1. ការយល់ដឹងដំបូង

ក្នុងដំណាក់កាលនេះ យើងត្រូវយល់អំពីគោលគំនិត និងវាក្យសព្ទមួយចំនួន ដើម្បីចៀសវាងការប្រព្រឹត្តខុសចំពោះមុខមនុស្សចាស់របស់យើង ដូចជា៖

សំណួរ៖ តើអ្វីជាភាពខុសគ្នារវាង RT-PCR, qPCR, Real-time PCR និង RT-PCR ពេលវេលាពិត?

ចម្លើយ៖ RT-PCR គឺជា PCR ប្រតិចារិកបញ្ច្រាស(PCR ចម្លងបញ្ច្រាស PCR, RT-PCR) ដែលជាវ៉ារ្យ៉ង់ដែលប្រើយ៉ាងទូលំទូលាយនៃប្រតិកម្មខ្សែសង្វាក់ polymerase (PCR) ។នៅក្នុង RT-PCR ខ្សែ RNA ត្រូវបានចម្លងបញ្ច្រាសទៅជា DNA បំពេញបន្ថែម ដែលបន្ទាប់មកត្រូវបានប្រើជាគំរូសម្រាប់ការពង្រីក DNA ដោយ PCR ។
ពេលវេលាពិត-PCR និង qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) គឺជារឿងដូចគ្នា ទាំងពីរគឺជា PCR បរិមាណពេលវេលាពិត ដែលមានន័យថា វដ្តនីមួយៗនៃ PCR មានកំណត់ត្រាទិន្នន័យពេលវេលាពិតប្រាកដ ដូច្នេះចំនួននៃគំរូចាប់ផ្តើមអាចត្រូវបានកែសម្រួលការវិភាគច្បាស់លាស់។

ទោះបីជា PCR ពេលវេលាពិត (PCR បរិមាណ fluorescent ពេលវេលាពិត) និង PCR ប្រតិចារិកបញ្ច្រាស (PCR បញ្ច្រាស) ហាក់ដូចជាអក្សរកាត់ជា RT-PCR ក៏ដោយ អនុសញ្ញាអន្តរជាតិគឺ៖ RT-PCR សំដៅជាពិសេសទៅលើការចម្លងបញ្ច្រាស។PCR , PCR ពេលវេលាពិត ជាទូទៅត្រូវបានកាត់ជា qPCR (PCR ពេលវេលាពិតបរិមាណ).

និងពេលវេលាពិតប្រាកដ RT-PCR (RT-qPCR) វាគឺជា PCR ប្រតិចារិកបញ្ច្រាសរួមបញ្ចូលគ្នាជាមួយនឹងបច្ចេកវិទ្យាបរិមាណ fluorescent៖ ដំបូងទទួលបាន cDNA (RT) ពីការចម្លងបញ្ច្រាស RNA ហើយបន្ទាប់មកប្រើ PCR ពេលវេលាពិតសម្រាប់ការវិភាគបរិមាណ (qPCR) ។មន្ទីរពិសោធន៍ភាគច្រើនធ្វើ RT-qPCR ពោលគឺការស្រាវជ្រាវលើ RNA expression down-regulation ដូច្នេះ qPCR ដែលគ្រប់គ្នានិយាយអំពីក្នុងមន្ទីរពិសោធន៍ពិតជាសំដៅទៅលើ RT-qPCR ប៉ុន្តែកុំភ្លេចថានៅតែមានការធ្វើតេស្ត DNA ជាច្រើននៅក្នុងកម្មវិធីព្យាបាល។ការវិភាគបរិមាណ ដូចជាការរកឃើញមេរោគរលាកថ្លើមប្រភេទ B មេរោគ HBV។

សំណួរ៖ បន្ទាប់ពីអាន PCR បរិមាណ fluorescent ច្រើន ហេតុអ្វីបានជាបំណែក amplified គួរតែត្រូវបានគ្រប់គ្រងក្នុងចន្លោះ 80-300bp?

ចម្លើយ៖ ប្រវែងនៃលំដាប់ហ្សែននីមួយៗគឺខុសគ្នា ខ្លះមានច្រើន kb ខ្លះរាប់រយ bp ប៉ុន្តែយើងគ្រាន់តែត្រូវការតម្រូវឱ្យប្រវែងផលិតផលគឺ 80-300bp នៅពេលរចនា primers ខ្លីពេក ឬវែងពេកមិនសមរម្យសម្រាប់ការរកឃើញ PCR បរិមាណ fluorescent ។បំណែកផលិតផលគឺខ្លីពេកដែលអាចត្រូវបានសម្គាល់ពី primer-dimer ។ប្រវែងនៃ primer-dimer គឺប្រហែល 30-40bp ហើយវាពិបាកក្នុងការបែងចែកថាតើវាជា primer-dimer ឬផលិតផលប្រសិនបើវាតិចជាង 80bp ។ប្រសិនបើបំណែកផលិតផលវែងពេក លើសពី 300bp វានឹងងាយស្រួលនាំទៅរកប្រសិទ្ធភាព amplification ទាប ហើយមិនអាចរកឃើញបរិមាណហ្សែនបានយ៉ាងមានប្រសិទ្ធភាព។

ឧទាហរណ៍ នៅពេលអ្នករាប់ចំនួនមនុស្សនៅក្នុងថ្នាក់រៀន អ្នកគ្រាន់តែត្រូវរាប់ចំនួនមាត់ប៉ុណ្ណោះ។ដូច​គ្នា​នេះ​ដែរ នៅ​ពេល​ដែល​អ្នក​រក​ឃើញ​ហ្សែន អ្នក​គ្រាន់​តែ​ត្រូវ​ការ​រក​ឃើញ​លំដាប់​ជាក់លាក់​នៃ​ហ្សែន​មួយ​ប៉ុណ្ណោះ ដើម្បី​តំណាង​ឱ្យ​លំដាប់​ទាំង​មូល​នឹង​ធ្វើ។បើ​ចង់​រាប់​មនុស្ស​ត្រូវ​រាប់​ទាំង​មាត់ ច្រមុះ ត្រចៀក និង​កែវ ហើយ​ងាយ​នឹង​ធ្វើ​ខុស។

ដើម្បីពង្រីក នៅក្នុងការស្រាវជ្រាវជីវសាស្រ្ត មានករណីស្រាវជ្រាវជាច្រើនពីចំណុចមួយទៅតំបន់មួយ ដោយសារតែលំដាប់ហ្សែននៃប្រភេទសត្វណាមួយមានរយៈពេលយូរ វាមិនចាំបាច់ និងមិនអាចវាស់វែងបាននូវបំណែកទាំងអស់ ដូចជាការបន្តពូជបាក់តេរី 16S ដែលជាការអនុវត្តន៍លំដាប់អភិរក្សនៃបាក់តេរី ការវិភាគដើម្បីសន្និដ្ឋានចំនួននៃចំនួនបាក់តេរីជាក់លាក់មួយ។

សំណួរ: តើប្រវែងល្អបំផុតសម្រាប់ការរចនាបឋម qPCR គឺជាអ្វី?

ចម្លើយ៖ ជាទូទៅ ប្រវែង primer គឺប្រហែល 20-24bp ដែលល្អជាង។ជាការពិតណាស់យើងត្រូវយកចិត្តទុកដាក់លើតម្លៃ TM នៃ primer នៅពេលរចនា primer ពីព្រោះវាទាក់ទងនឹងសីតុណ្ហភាពល្អបំផុត។បន្ទាប់ពីការពិសោធន៍ជាច្រើន វាត្រូវបានបង្ហាញថា 60°C គឺជាតម្លៃ TM ប្រសើរជាងមុន។ប្រសិនបើសីតុណ្ហភាព annealing ទាបពេក វានឹងងាយនាំទៅរកការពង្រីកមិនជាក់លាក់។ប្រសិនបើសីតុណ្ហភាព annealing ខ្ពស់ពេក ប្រសិទ្ធភាព amplification នឹងទាប ចំនុចកំពូលនៃ amplification curve នឹងចាប់ផ្តើមនៅពេលក្រោយ ហើយតម្លៃ CT នឹងត្រូវបានពន្យារពេល។

សំណួរ៖ តើ​វិធី​ជ្រលក់​ពណ៌​ខុស​ពី​វិធីសាស្ត្រ​អង្កេត​យ៉ាង​ដូចម្តេច?

ចម្លើយ៖ វិធីសាស្ត្រលាបពណ៌សារធាតុពណ៌ fluorescent មួយចំនួនដូចជា SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO ជាដើម មិនបញ្ចេញពន្លឺដោយខ្លួនឯងទេ ប៉ុន្តែនឹងបញ្ចេញពន្លឺបន្ទាប់ពីភ្ជាប់ទៅនឹងចង្អូរតូចៗនៃ DNA ពីរខ្សែ។ដូច្នេះនៅដើមដំបូងនៃប្រតិកម្ម PCR ម៉ាស៊ីនមិនអាចរកឃើញសញ្ញា fluorescent បានទេ។នៅពេលដែលប្រតិកម្មឈានដល់ដំណាក់កាល annealing-extension នោះ strand ទ្វេត្រូវបានបើក ហើយ strand ថ្មីមួយត្រូវបានសំយោគនៅក្រោមសកម្មភាពរបស់ DNA polymerase ហើយម៉ូលេគុល fluorescent ភ្ជាប់ទៅនឹង groove តូច dsDNA ។នៅពេលដែលចំនួននៃវដ្ត PCR កើនឡើង ការជ្រលក់ពណ៌កាន់តែច្រើនត្រូវបានផ្សំជាមួយនឹង DNA ពីរខ្សែ ហើយសញ្ញា fluorescent ក៏ត្រូវបានពង្រឹងជាបន្តបន្ទាប់ផងដែរ។វិធីសាស្រ្តនៃការជ្រលក់ពណ៌ត្រូវបានប្រើជាចម្បងនៅក្នុងការស្រាវជ្រាវវិទ្យាសាស្ត្រ។
PS: សូមប្រយ័ត្នពេលធ្វើការពិសោធន៍ ថ្នាំជ្រលក់ត្រូវផ្សំជាមួយ DNA របស់មនុស្ស ប្រយ័ត្នប្រែក្លាយវាទៅជា fluorescent ។

វិធីសាស្ត្រជ្រលក់ (ឆ្វេង) វិធីសាស្ត្រអង្កេត (ស្តាំ)
PS: សូមប្រយ័ត្នពេលធ្វើការពិសោធន៍ ថ្នាំជ្រលក់ត្រូវផ្សំជាមួយ DNA របស់មនុស្ស ប្រយ័ត្នប្រែក្លាយវាទៅជា fluorescent ។

SYBR Green Ⅰ ភ្ជាប់ទៅនឹងចង្អូរតូចៗនៃ DNA

វិធីសាស្រ្តស៊ើបអង្កេតការស៊ើបអង្កេត Taqman គឺជាឧបករណ៍ស្ទង់អ៊ីដ្រូលីស៊ីសដែលប្រើជាទូទៅបំផុត។មានក្រុម fluorescent នៅចុង 5′ នៃការស៊ើបអង្កេត ជាធម្មតា FAM ហើយការស៊ើបអង្កេតខ្លួនវាគឺជាលំដាប់ដែលបំពេញបន្ថែមទៅនឹងហ្សែនគោលដៅ។មានក្រុមពន្លត់ភ្លើង fluorescent នៅចុង 3′។យោងទៅតាមគោលការណ៍នៃការផ្ទេរថាមពល fluorescent resonance (Förster resonance energy transfer, FRET) នៅពេលដែលក្រុម fluorescent អ្នកយកព័ត៌មាន (ម៉ូលេគុល fluorescent ម្ចាស់ជំនួយ) និងក្រុម fluorescent quenching (acceptor fluorescent molecule) មានការរំភើបនៅពេលដែល spectra overlap និងចំងាយជិតគ្នា (7-10nm) ការ donorecitation ម៉ូលេគុលអាចទទួលយកបាន ខណៈពេលដែល autofluorescence ត្រូវបានចុះខ្សោយ។ដូច្នេះហើយ នៅដើមដំបូងនៃប្រតិកម្ម PCR នៅពេលដែលការស៊ើបអង្កេតគឺឥតគិតថ្លៃ និងនៅដដែលនៅក្នុងប្រព័ន្ធ ក្រុម fluorescent អ្នករាយការណ៍នឹងមិនបញ្ចេញ fluorescence ទេ។នៅពេលដែល annealing, primer និង probe ចងទៅនឹងគំរូ។ក្នុងកំឡុងដំណាក់កាលពង្រីក សារធាតុប៉ូលីមេរ៉ាសបន្តសំយោគខ្សែសង្វាក់ថ្មី។DNA polymerase មានសកម្មភាព 5'-3' exonuclease ។នៅពេលឈានដល់ការស៊ើបអង្កេត DNA polymerase នឹង hydrolyze ការស៊ើបអង្កេតពីគំរូ បំបែកក្រុម fluorescent អ្នករាយការណ៍ពីក្រុម quencher fluorescent និងបញ្ចេញសញ្ញា fluorescent ។ដោយសារមានទំនាក់ទំនងមួយទល់នឹងមួយរវាងការស៊ើបអង្កេត និងគំរូ វិធីសាស្ត្រស៊ើបអង្កេតគឺប្រសើរជាងវិធីសាស្ត្រជ្រលក់ក្នុងលក្ខខណ្ឌនៃភាពត្រឹមត្រូវ និងភាពប្រែប្រួលនៃការធ្វើតេស្ត។វិធីសាស្រ្តស៊ើបអង្កេតត្រូវបានប្រើជាចម្បងក្នុងការធ្វើរោគវិនិច្ឆ័យ។

Q: តើបរិមាណដាច់ខាតគឺជាអ្វី?តើ Relative Quantification ជាអ្វី?

ចម្លើយ៖ បរិមាណដាច់ខាត សំដៅលើការគណនាលេខចម្លងដំបូងនៃគំរូដែលត្រូវធ្វើតេស្តដោយ qPCR ដូចជាចំនួនមេរោគ HBV ក្នុងឈាម 1ml។លទ្ធផលដែលទទួលបានដោយបរិមាណដែលទាក់ទងគឺការផ្លាស់ប្តូរបរិមាណនៃហ្សែនគោលដៅនៅក្នុងគំរូជាក់លាក់មួយទាក់ទងទៅនឹងគំរូយោងផ្សេងទៀត ហើយកន្សោមហ្សែនត្រូវបានគ្រប់គ្រងឡើង ឬចុះក្រោម។

សំណួរ៖ តើបរិមាណនៃការទាញយក RNA ប្រសិទ្ធភាពនៃការចម្លងបញ្ច្រាស និងប្រសិទ្ធភាពពង្រីកប៉ះពាល់ដល់លទ្ធផលពិសោធន៍ដែរឬទេ?
សំណួរ៖ តើការផ្ទុកគំរូ សារធាតុចម្រាញ់ សារធាតុចម្លងបញ្ច្រាស និងឧបករណ៍ប្រើប្រាស់បញ្ជូនពន្លឺនឹងប៉ះពាល់ដល់លទ្ធផលពិសោធន៍ដែរឬទេ?
សំណួរ៖ តើ​វិធីសាស្ត្រ​អ្វី​ដែល​អាច​កែតម្រូវ​ទិន្នន័យ​ពិសោធន៍?

ទាក់ទងនឹងបញ្ហាទាំងនេះ យើងនឹងរៀបរាប់លម្អិតនៅក្នុងផ្នែកកម្រិតខ្ពស់ និងកម្រិតខ្ពស់ខាងក្រោម។
2. ចំណេះដឹងកម្រិតខ្ពស់

ទាក់ទងទៅនឹង PCR បរិមាណ fluorescent ពេលវេលាពិតប្រាកដ យើងត្រូវទទួលស្គាល់ការពិតដែលឯកសារស្រាវជ្រាវវិទ្យាសាស្ត្ររាប់ពាន់ត្រូវបានបោះពុម្ពជារៀងរាល់ឆ្នាំ ក្នុងចំណោមនោះ បច្ចេកវិទ្យា PCR បរិមាណ fluorescent មិនមែនជាចំនួនតិចតួចទេ។

ប្រសិនបើមិនមានស្តង់ដារទូទៅដើម្បីវាស់ស្ទង់ការពិសោធន៍ PCR បរិមាណ fluorescent នោះលទ្ធផលអាចប្រែប្រួលយ៉ាងទូលំទូលាយ។ចំពោះហ្សែនដូចគ្នានៃប្រភេទដូចគ្នា ជាមួយនឹងវិធីសាស្ត្រកែច្នៃដូចគ្នា លទ្ធផលរកឃើញក៏នឹងប្រែប្រួលយ៉ាងទូលំទូលាយដែរ ហើយវានឹងពិបាកសម្រាប់អ្នកដែលមកយឺតក្នុងការធ្វើម្តងទៀតនូវលទ្ធផលដូចគ្នា។អ្នក​គ្មាន​នរណា​ដឹង​ថា​មួយ​ណា​ត្រូវ និង​មួយ​ណា​ខុស។

តើនេះមានន័យថា fluorescent quantitative PCR គឺជាបច្ចេកវិទ្យាបោកប្រាស់ ឬជាបច្ចេកវិជ្ជាដែលមិនគួរឱ្យទុកចិត្ត?ទេ វាគឺដោយសារតែ PCR បរិមាណ fluorescent មានភាពរសើប និងត្រឹមត្រូវជាង ហើយប្រតិបត្តិការខុសបន្តិចបន្តួចនឹងផ្តល់លទ្ធផលផ្ទុយទាំងស្រុង។ការបាត់បង់តូចមួយនៅចម្ងាយមួយពាន់គីឡូម៉ែត្រ.អ្នកនិពន្ធអត្ថបទអាចត្រូវបានធ្វើទារុណកម្មម្តងហើយម្តងទៀតដោយអ្នកត្រួតពិនិត្យ។ទន្ទឹមនឹងនេះដែរ អ្នកត្រួតពិនិត្យទិនានុប្បវត្តិក៏ពិបាកក្នុងការជ្រើសរើសពីលទ្ធផលពិសោធន៍ផ្សេងៗ។

សរុបមក ចង្អុលទៅការខ្វះខាតនៃការយល់ស្របនៅក្នុងការពិសោធន៍ PCR ពេលវេលាជាក់ស្តែង។ដល់ទីបញ្ចប់នេះ អ្នកវិទ្យាសាស្ត្រជាន់ខ្ពស់ក្នុងឧស្សាហកម្មបានចាប់ផ្តើមបង្កើតស្តង់ដារតម្រូវ​ឱ្យ​អ្នក​ចូល​រួម​ផ្តល់​ជូន​នូវ​សេចក្តី​លម្អិត​នៃ​ការ​ពិសោធន៍​ និង​ដំណើរការ​ទិន្នន័យ​ចាំបាច់​មួយ​ចំនួន (រួម​ទាំង​ទិន្នន័យ​ចាំបាច់) ក្នុង​អត្ថបទ​ដើម្បី​បំពេញ​តាម​ស្តង់ដារ​ទាំងនេះ។

អ្នកត្រួតពិនិត្យអាចវិនិច្ឆ័យគុណភាពនៃការពិសោធន៍ដោយអានព័ត៌មានលម្អិតទាំងនេះ។អ្នកអាននាពេលអនាគតក៏អាចប្រើវាដើម្បីធ្វើការពិសោធន៍ឡើងវិញ ឬកែលម្អការពិសោធន៍ផងដែរ។បន្ទាប់មក លទ្ធផលពិសោធន៍ដែលទទួលបានតាមវិធីនេះគឺពោរពេញដោយព័ត៌មាន គុណភាពខ្ពស់ និងអាចប្រើប្រាស់បាន។

MIBBI (ព័ត៌មានអប្បបរមាសម្រាប់ការស៊ើបអង្កេតជីវសាស្ត្រ និងជីវវេជ្ជសាស្ត្រ -http://www.mibbi.org) បានក្លាយជា។MIBBI គឺជាគម្រោងដែលផ្តល់នូវស្តង់ដារសម្រាប់ការពិសោធន៍.វាត្រូវបានបោះពុម្ពនៅក្នុងធម្មជាតិ។គម្រោងនេះមានគោលបំណងលើការពិសោធន៍ជីវសាស្រ្តផ្សេងៗ រួមទាំងជីវវិទ្យាកោសិកា មីក្រូអារេ qPCR ដែលយើងនឹងពិភាក្សាឥឡូវនេះ។ល។ និងផ្តល់សម្រាប់ប្រភេទនីមួយៗនៃការពិសោធន៍នៅពេលដាក់ស្នើសាត្រាស្លឹករឹត។ព័ត៌មាននោះគួរតែត្រូវបានផ្តល់ជូនគ្រប់ពេលវេលា។

នៅក្នុងគម្រោង MIBBI មានអត្ថបទពីរដែលទាក់ទងនឹង PCR បរិមាណ fluorescent គឺ:
· RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) - ជាភាសាដែលមានរចនាសម្ព័ន្ធ និងការណែនាំអំពីរបាយការណ៍សម្រាប់ទិន្នន័យ PCR បរិមាណតាមពេលវេលាជាក់ស្តែង។
· MIQE (ព័ត៌មានអប្បបរមាសម្រាប់ការបោះពុម្ពផ្សាយនៃការពិសោធន៍ PCR ពេលវេលាជាក់ស្តែងបរិមាណ) - ព័ត៌មានអប្បបរមាសម្រាប់ការបោះពុម្ពផ្សាយអត្ថបទអំពីការពិសោធន៍ PCR បរិមាណតាមពេលវេលាជាក់ស្តែង។
ដំបូងសូមនិយាយអំពី RDML ដែលជាការបញ្ជាក់វាក្យស័ព្ទ។

ប្រសិនបើមិនមាននិយមន័យស្តង់ដារសម្រាប់អ្វីគ្រប់យ៉ាងទេនោះ វាមិនអាចទៅរួចទេក្នុងការបន្តការពិភាក្សា ដែលជាមូលហេតុដែលការពន្យល់ពាក្យមានសារៈសំខាន់ណាស់ក្នុងការប្រឡង។
ពាក្យដែលប្រើក្នុងការពិសោធន៍ PCR បរិមាណ fluorescent រួមមានខ្លឹមសារដូចខាងក្រោម។QIAGEN បានធ្វើសេចក្តីសង្ខេបដ៏ល្អបំផុតសម្រាប់ពួកយើង។ខាងក្រោមគឺស្ងួតទាំងអស់។ទំនិញ .

ខ្សែកោងពង្រីក
ខ្សែកោង amplification សំដៅទៅលើខ្សែកោងដែលបានធ្វើឡើងកំឡុងពេលដំណើរការ PCR ជាមួយនឹងលេខវដ្តជា abscissa និងអាំងតង់ស៊ីតេ fluorescence ក្នុងពេលវេលាជាក់ស្តែង កំឡុងពេលប្រតិកម្មជាការចាត់តាំង។

ខ្សែកោង amplification ដ៏ល្អគួរតែមានលក្ខណៈដូចខាងក្រោម៖ បន្ទាត់គោលគឺសំប៉ែត ឬថយចុះបន្តិច ហើយមិនមាននិន្នាការកើនឡើងជាក់ស្តែងទេ។ចំនុចបញ្ឆេះនៃខ្សែកោងគឺច្បាស់ ហើយចំណោទនៃដំណាក់កាលអិចស្ប៉ូណង់ស្យែលគឺសមាមាត្រទៅនឹងប្រសិទ្ធភាពនៃការពង្រីក។ជម្រាលកាន់តែច្រើន ប្រសិទ្ធភាពពង្រីកកាន់តែខ្ពស់;ខ្សែកោង amplification ទាំងមូល ភាពស្របគ្នាគឺល្អ ដែលបង្ហាញថាប្រសិទ្ធភាព amplification នៃបំពង់នីមួយៗគឺស្រដៀងគ្នា។ដំណាក់កាលអិចស្ប៉ូណង់ស្យែលនៃខ្សែកោងពង្រីកនៃគំរូកំហាប់ទាបគឺជាក់ស្តែង។

បន្ទាត់មូលដ្ឋាន (មូលដ្ឋាន)
បន្ទាត់មូលដ្ឋានគឺជាកម្រិតសំលេងរំខាននៃវដ្តដំបូងជាធម្មតាត្រូវបានវាស់នៅចន្លោះវដ្ដទី 3 និងទី 15 ពីព្រោះតម្លៃ fluorescence កើនឡើងដែលបណ្តាលមកពីផលិតផល amplification មិនអាចត្រូវបានរកឃើញក្នុងអំឡុងពេលនេះ។ចំនួនវដ្ដដែលប្រើដើម្បីគណនាបន្ទាត់គោលអាចប្រែប្រួល ហើយអាចនឹងត្រូវកាត់បន្ថយប្រសិនបើបរិមាណគំរូខ្ពស់ត្រូវបានប្រើ ឬប្រសិនបើកម្រិតកន្សោមនៃហ្សែនគោលដៅខ្ពស់។

ការកំណត់បន្ទាត់មូលដ្ឋានតម្រូវឱ្យមើលទិន្នន័យ fluorescence ពីខ្សែកោងពង្រីកលីនេអ៊ែរ។បន្ទាត់មូលដ្ឋានត្រូវបានកំណត់ ដូច្នេះការលូតលាស់នៃខ្សែកោងពង្រីកចាប់ផ្តើមដោយលេខវដ្តធំជាងលេខកំពូលនៃវដ្តមូលដ្ឋាន។មូលដ្ឋានចាំបាច់ត្រូវកំណត់ជាលក្ខណៈបុគ្គលសម្រាប់លំដាប់គោលដៅនីមួយៗ។តម្លៃ fluorescence ជាមធ្យមដែលបានរកឃើញនៅក្នុងវដ្តដំបូងចាំបាច់ត្រូវដកចេញពីតម្លៃ fluorescence ដែលទទួលបាននៅក្នុងផលិតផល amplified ។កំណែចុងក្រោយបំផុតនៃកម្មវិធី PCR ពេលវេលាពិតជាច្រើនអនុញ្ញាតឱ្យបង្កើនប្រសិទ្ធភាពដោយស្វ័យប្រវត្តិនៃការកំណត់មូលដ្ឋានសម្រាប់គំរូបុគ្គល។

ក្នុងអំឡុងពេលពីរបីដំបូងនៃប្រតិកម្ម PCR amplification សញ្ញា fluorescence មិនផ្លាស់ប្តូរច្រើនទេ។ការចូលទៅជិតបន្ទាត់ត្រង់មួយត្រូវបានគេហៅថាបន្ទាត់មូលដ្ឋាន ប៉ុន្តែប្រសិនបើយើងពិនិត្យមើលឱ្យជិតនៅរង្វង់ពីរបីដំបូងយើងឃើញថានៅក្នុងបន្ទាត់មូលដ្ឋានគឺជាអ្វីដែលកំពុងកើតឡើងនៅក្នុងរូបភាពខាងក្រោម។

ផ្ទៃខាងក្រោយផ្ទៃខាងក្រោយសំដៅទៅលើ
តម្លៃ fluorescence មិនជាក់លាក់នៅក្នុងប្រតិកម្ម។ឧទាហរណ៍ៈ ការពន្លត់ភ្លើងហ្វ្លុយអូរីមិនមានប្រសិទ្ធភាព;ឬមួយចំនួនធំនៃគំរូ DNA ដែលមានខ្សែពីរ ដោយសារការប្រើប្រាស់ SYBR Green។សមាសធាតុផ្ទៃខាងក្រោយនៃសញ្ញាត្រូវបានដកចេញតាមគណិតវិទ្យាដោយក្បួនដោះស្រាយកម្មវិធី PCR ពេលវេលាពិត។

សញ្ញាអ្នករាយការណ៍
សញ្ញាអ្នករាយការណ៍ សំដៅលើសញ្ញា fluorescent ដែលបង្កើតដោយ SYBR Green ឬការស៊ើបអង្កេតតាមលំដាប់ជាក់លាក់ដែលមានស្លាក fluorescently ក្នុងអំឡុងពេល PCR ពេលវេលាពិត។

សញ្ញាអ្នករាយការណ៍ធម្មតា (RN)
RN សំដៅទៅលើអាំងតង់ស៊ីតេ fluorescence នៃការជ្រលក់ពណ៌អ្នកយកព័ត៌មាន បែងចែកដោយអាំងតង់ស៊ីតេ fluorescence នៃសារធាតុពណ៌យោងអកម្មដែលត្រូវបានវាស់នៅវដ្តនីមួយៗ។

ថ្នាំជ្រលក់យោងអកម្ម
នៅក្នុង PCRs ពេលវេលាពិតមួយចំនួន,សារធាតុ fluorescent dye ROX ត្រូវបានប្រើជាឯកសារយោងខាងក្នុង ដើម្បីធ្វើឱ្យសញ្ញា fluorescent មានលក្ខណៈធម្មតា។.វាកែតម្រូវសម្រាប់ការប្រែប្រួលដោយសារតែបំពង់បង្ហូរមិនត្រឹមត្រូវ ទីតាំងអណ្តូង និងការប្រែប្រួល fluorescence នៅលើមូលដ្ឋានល្អដោយអណ្តូង។

កម្រិតពន្លឺ (កម្រិតពន្លឺ)
ត្រូវបានកែតម្រូវនៅខាងលើតម្លៃផ្ទៃខាងក្រោយ និងយ៉ាងសំខាន់នៅខាងក្រោមតម្លៃខ្ពង់រាបនៃខ្សែកោងពង្រីក។វាត្រូវតែស្ថិតនៅក្នុងតំបន់លីនេអ៊ែរនៃខ្សែកោង amplification ដែលតំណាងឱ្យជួរ log-linear នៃការរកឃើញ PCR ។កម្រិតចាប់ផ្ដើមគួរតែត្រូវបានកំណត់នៅក្នុងទិដ្ឋភាពខ្សែកោងនៃការពង្រីកកំណត់ហេតុ ដូច្នេះថាដំណាក់កាលកំណត់ហេតុ-លីនេអ៊ែរនៃ PCR អាចកំណត់អត្តសញ្ញាណបានយ៉ាងងាយស្រួល។ប្រសិនបើមានហ្សែនគោលដៅច្រើននៅក្នុង Real-Time PCR នោះកម្រិតត្រូវតែកំណត់សម្រាប់គោលដៅនីមួយៗ។ជាទូទៅ សញ្ញា fluorescence នៃ 15 វដ្តដំបូងនៃប្រតិកម្ម PCR ត្រូវបានប្រើជាសញ្ញាផ្ទៃខាងក្រោយ fluorescence ហើយកម្រិតពន្លឺនៃ fluorescence គឺ 10 ដងនៃគម្លាតស្តង់ដារនៃសញ្ញា fluorescence នៃ 3 ទៅ 15 វដ្តដំបូងនៃ PCR ហើយកម្រិត fluorescence ត្រូវបានកំណត់នៅក្នុងដំណាក់កាល ពង្រីក PCR ។ជាទូទៅ ឧបករណ៍នីមួយៗមានកម្រិត fluorescence របស់វាដែលបានកំណត់មុនពេលប្រើប្រាស់។

កម្រិតរង្វង់ (CT) ឬចំណុចឆ្លងកាត់ (CP)
វដ្ដ​ដែល​ខ្សែកោង​ពង្រីក​ឆ្លង​កាត់​កម្រិត​កំណត់ (ឧ. ចំណុច​ដែល​ការ​រក​ឃើញ​ពន្លឺ​កើនឡើង​ខ្លាំង)។CT អាចជាប្រភាគ ហើយបរិមាណនៃគំរូចាប់ផ្តើមអាចត្រូវបានគណនា។តម្លៃ CT តំណាងឱ្យចំនួនវដ្តដែលបានជួបប្រទះនៅពេលដែលសញ្ញា fluorescent នៅក្នុងបំពង់ប្រតិកម្ម PCR នីមួយៗឈានដល់កម្រិតកំណត់។មានទំនាក់ទំនងលីនេអ៊ែររវាងតម្លៃ CT នៃគំរូនីមួយៗ និងលោការីតនៃលេខច្បាប់ចម្លងដំបូងនៃគំរូ។ខ្ពស់ជាងលេខចម្លងដំបូង តម្លៃ CT កាន់តែតូច ហើយផ្ទុយទៅវិញ.ខ្សែកោងស្ដង់ដារអាចត្រូវបានធ្វើឡើងដោយប្រើស្តង់ដារដែលមានលេខច្បាប់ចម្លងដំបូងដែលគេស្គាល់ ដែលក្នុងនោះ abscissa តំណាងឱ្យតម្លៃ CT ហើយ ordinate តំណាងឱ្យលោការីតនៃលេខចម្លងដំបូង។ដូច្នេះ ដរាបណាតម្លៃ CT នៃគំរូមិនស្គាល់ត្រូវបានទទួល លេខចម្លងដំបូងនៃគំរូអាចត្រូវបានគណនាពីខ្សែកោងស្តង់ដារ។

តម្លៃ ΔCT
តម្លៃ ΔCT ពិពណ៌នាភាពខុសគ្នារវាងហ្សែនគោលដៅ និងតម្លៃ CT ហ្សែនយោង endogenous ដែលត្រូវគ្នា។ដូចជា ហ្សែនថែរក្សាផ្ទះ និងត្រូវបានប្រើដើម្បីធ្វើឱ្យបរិមាណគំរូដែលបានប្រើជាធម្មតា៖
⇒ΔCT = CT (ហ្សែនគោលដៅ) - CT (ហ្សែនយោង endogenous)

ΔΔ CT តម្លៃ
តម្លៃ ΔΔCT ពិពណ៌នាអំពីភាពខុសគ្នារវាងតម្លៃមធ្យម ΔΔCT នៃគំរូចំណាប់អារម្មណ៍ (ឧទាហរណ៍ កោសិកាដែលជំរុញ) និងតម្លៃមធ្យម ΔΔCT នៃគំរូយោង (ឧទាហរណ៍ កោសិកាដែលមិនបានរំញោច)។សំណាក​យោង​ត្រូវ​បាន​គេ​ហៅ​ផង​ដែរ​ថា​សំណាក​ការ​ក្រិត​តាម​ខ្នាត​ហើយ​សំណាក​ផ្សេង​ទៀត​ទាំង​អស់​ត្រូវ​បាន​ធ្វើ​ឱ្យ​ធម្មតា​ទៅ​នេះ​សម្រាប់​បរិមាណ​ដែល​ទាក់ទង​:
⇒ΔΔCT = ΔCT មធ្យម (គំរូចំណាប់អារម្មណ៍) - ΔCT មធ្យម (គំរូយោង)

ហ្សែនយោង endogenous (ហ្សែនយោង endogenous)
កម្រិតកន្សោមនៃហ្សែនយោង endogenous ដូចជាហ្សែនថែរក្សាផ្ទះ (ហ្សែនថែរក្សាផ្ទះ) មិនខុសគ្នារវាងគំរូនោះទេ។ការប្រៀបធៀបតម្លៃ CT នៃហ្សែនយោងទៅនឹងហ្សែនគោលដៅអនុញ្ញាតឱ្យកម្រិតការបញ្ចេញមតិនៃហ្សែនគោលដៅត្រូវបានធ្វើឱ្យមានលក្ខណៈធម្មតាទៅនឹងបរិមាណបញ្ចូល RNA ឬ cDNA (សូមមើលផ្នែកនៅលើតម្លៃ ΔCT ខាងលើ) ។

ហ្សែនយោងខាងក្នុងត្រឹមត្រូវសម្រាប់ការរិចរិល RNA ដែលអាចកើតមាន ឬវត្តមាននៃអង់ស៊ីម inhibitors នៅក្នុងគំរូ RNA ក៏ដូចជាការប្រែប្រួលនៃមាតិកា RNA ប្រសិទ្ធភាពនៃការចម្លងបញ្ច្រាស ការស្ដារអាស៊ីត nucleic និងការដោះស្រាយគំរូ។ដើម្បីជ្រើសរើសហ្សែនឯកសារយោងដ៏ល្អប្រសើរ យើងបានកែប្រែក្បួនដោះស្រាយដើម្បីអនុញ្ញាតឱ្យជ្រើសរើសរបស់វានូវឯកសារយោងដ៏ល្អប្រសើរអាស្រ័យលើការកំណត់ពិសោធន៍។

ការគ្រប់គ្រងផ្ទៃក្នុង
លំដាប់វត្ថុបញ្ជាដែលត្រូវបានពង្រីកនៅក្នុងប្រតិកម្មដូចគ្នាទៅនឹងលំដាប់គោលដៅ ហើយត្រូវបានស៊ើបអង្កេតជាមួយការស៊ើបអង្កេតផ្សេងគ្នា (ឧ. ដំណើរការ PCR ពីរ)។ការគ្រប់គ្រងខាងក្នុងត្រូវបានប្រើជាញឹកញាប់ដើម្បីបដិសេធការពង្រីកដែលបរាជ័យ ដូចជានៅពេលដែលលំដាប់គោលដៅមិនត្រូវបានរកឃើញ។
គំរូក្រិត
សំណាកយោង (ឧទាហរណ៍ RNA បន្សុតពីបន្ទាត់កោសិកា ឬជាលិកា) ដែលប្រើក្នុងបរិមាណទាក់ទងដើម្បីប្រៀបធៀបគំរូផ្សេងទៀតទាំងអស់ដើម្បីកំណត់កម្រិតនៃការបញ្ចេញមតិដែលទាក់ទងនៃហ្សែនមួយ។សំណាក​ការ​ក្រិត​តាម​ខ្នាត​អាច​ជា​សំណាក​ណា​មួយ ប៉ុន្តែ​ជា​ធម្មតា​ជា​វត្ថុ​បញ្ជា (ឧទាហរណ៍ គំរូ​ដែល​មិន​បាន​ព្យាបាល ឬ​គំរូ​ពី​ពេលវេលា​សូន្យ​នៃ​ការ​ពិសោធន៍)។

ការត្រួតពិនិត្យជាវិជ្ជមាន
ប្រើប្រតិកម្មគ្រប់គ្រងជាមួយចំនួនគំរូដែលគេស្គាល់.ការត្រួតពិនិត្យជាវិជ្ជមានត្រូវបានគេប្រើជាញឹកញាប់ដើម្បីពិនិត្យមើលថាសំណុំ primer ឬ primer-probe set ដំណើរការបានត្រឹមត្រូវ ហើយថាប្រតិកម្មត្រូវបានតំឡើងយ៉ាងត្រឹមត្រូវ។

គ្មានការគ្រប់គ្រងគំរូ (NTC)
ប្រតិកម្មគ្រប់គ្រងដែលមានសមាសធាតុចាំបាច់ទាំងអស់នៃប្រតិកម្ម amplification លើកលែងតែគំរូដែលជាធម្មតាត្រូវបានជំនួសដោយទឹក។ការប្រើប្រាស់ NTC អាចរកឃើញការចម្លងរោគដែលបណ្តាលមកពីការចម្លងរោគ reagent ឬ DNA បរទេស ដូច្នេះធានាបាននូវភាពត្រឹមត្រូវនិងភាពជឿជាក់នៃទិន្នន័យរាវរក។ការពង្រីកការត្រួតពិនិត្យ NTC បង្ហាញពីការចម្លងរោគ។

គ្មានការគ្រប់គ្រង RT (NRT)
ដំណើរការទាញយក RNA អាចមាន DNA ហ្សែនដែលនៅសេសសល់ ដែលមានគ្រោះថ្នាក់ខ្លាំង ហើយជាពិរុទ្ធជនដែលប៉ះពាល់ដល់គុណភាពទិន្នន័យ និងជាសត្រូវធម្មជាតិរបស់ qPCR ដូច្នេះនៅពេលរចនាការពិសោធន៍ វាត្រូវតែត្រូវបានរចនាឡើងដើម្បីពង្រីកការរកឃើញ RNA ប៉ុណ្ណោះ។មានវិធីពីរយ៉ាង មួយគឺរចនា primers ឆ្លងកាត់ introns មួយទៀតគឺត្រូវដក DNA ចេញទាំងស្រុង តើមួយណាល្អជាង ដែលនឹងពិភាក្សានៅពេលក្រោយ។ការត្រួតពិនិត្យ NTR គឺជាកញ្ចក់វេទមន្តដើម្បីរកមើលការបំពុល DNA ។ប្រសិនបើមានការពង្រីកវាមានន័យថាមានការបំពុល។

ស្តង់ដារ
ស្តង់ដារគឺជាគំរូនៃការប្រមូលផ្តុំដែលគេស្គាល់ ឬលេខចម្លងដែលត្រូវបានប្រើដើម្បីបង្កើតខ្សែកោងស្តង់ដារ។ដើម្បីធានាបាននូវស្ថេរភាពនៃស្តង់ដារ បំណែកហ្សែនជាធម្មតាត្រូវបានក្លូនចូលទៅក្នុងប្លាស្មា ហើយប្រើជាស្តង់ដារ។

ខ្សែកោងស្តង់ដារ
ជាធម្មតាត្រូវបានពនឺទៅជាជម្រាលកំហាប់យ៉ាងហោចណាស់ 5 ជាមួយនឹងផលិតផលស្តង់ដារយោងតាមសមាមាត្រទ្វេរដង ហើយ 5 ពិន្ទុត្រូវបានគូរក្នុងកូអរដោណេនៃតម្លៃ CT និងលេខចម្លង ហើយចំនុចត្រូវបានភ្ជាប់ដើម្បីបង្កើតជាខ្សែបន្ទាត់ដើម្បីបង្កើតខ្សែកោងស្តង់ដារ។សម្រាប់ខ្សែកោងស្តង់ដារនីមួយៗ សុពលភាពរបស់វាត្រូវពិនិត្យ។តម្លៃជម្រាលធ្លាក់នៅចន្លោះ -3.3 និង -3.8 ហើយការផ្តោតអារម្មណ៍នីមួយៗត្រូវបានអនុវត្តជាបីដង។ចំណុចដែលខុសគ្នាខ្លាំងពីចំណុចផ្សេងទៀតគួរតែត្រូវបានគេបោះបង់ចោល។តម្លៃ CT នៃគំរូដែលត្រូវធ្វើតេស្តត្រូវបាននាំយកទៅក្នុងខ្សែកោងស្តង់ដារ ហើយកម្រិតកន្សោមនៃគំរូដែលត្រូវធ្វើតេស្តអាចត្រូវបានគណនា។

តម្លៃ CT នៃគំរូដែលត្រូវធ្វើតេស្តត្រូវបាននាំយកទៅក្នុងខ្សែកោងស្តង់ដារ ហើយលេខចម្លងដំបូងនៃគំរូដែលត្រូវធ្វើតេស្តអាចត្រូវបានគណនា។

ប្រសិទ្ធភាពនិងជម្រាល
ជម្រាលនៃខ្សែកោងស្តង់ដារតំណាងឱ្យប្រសិទ្ធភាពនៃ PCR ពេលវេលាជាក់ស្តែង។
· ជម្រាលនៃ -3.322 បង្ហាញថាប្រសិទ្ធភាពពង្រីក PCR គឺ 1 ឬ 100% ប្រសិទ្ធភាព ហើយបរិមាណនៃផលិតផល PCR កើនឡើងទ្វេដងនៅវដ្តនីមួយៗ។
· ជម្រាលតិចជាង -3.322 (ឧទាហរណ៍ -3.8) បង្ហាញពីប្រសិទ្ធភាព PCR
· ជម្រាលធំជាង -3.322 (ឧ. -3.0) បង្ហាញថាប្រសិទ្ធភាព PCR ហាក់ដូចជាធំជាង 100% ដែលជាការចង់ដឹងចង់ឃើញ តើវដ្តមួយរបស់ PCR អាចបង្កើតផលិតផលពង្រីកលើសពីទ្វេដងយ៉ាងដូចម្តេច?ស្ថានភាពនេះកើតឡើងនៅក្នុងដំណាក់កាលមិនមែនលីនេអ៊ែរនៃប្រតិកម្ម PCR ពោលគឺមានបរិមាណដ៏ធំនៃ amplification មិនជាក់លាក់។

ខ្សែកោងរលាយ
បន្ទាប់ពីការពង្រីក qPCR ត្រូវបានបញ្ចប់ ផលិតផល PCR ត្រូវបានកំដៅ។នៅពេលដែលសីតុណ្ហភាពកើនឡើង ផលិតផលពង្រីកខ្សែទ្វេរនឹងរលាយបន្តិចម្តងៗ ដែលបណ្តាលឱ្យមានការថយចុះនៃអាំងតង់ស៊ីតេ fluorescence ។នៅពេលដែលសីតុណ្ហភាពជាក់លាក់មួយ (Tm) ត្រូវបានឈានដល់ ផលិតផលមួយចំនួនធំនឹងរលាយ។Fluorescence ធ្លាក់ចុះយ៉ាងខ្លាំង។ផលិតផល PCR ផ្សេងៗគ្នាមានតម្លៃ Tm ខុសៗគ្នា និងសីតុណ្ហភាពរលាយខុសៗគ្នា ដូច្នេះភាពជាក់លាក់នៃ PCR អាចត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណ។

ខ្សែកោងរលាយ (ខ្សែកោងដេរីវេ)
ខ្សែកោងរលាយត្រូវបានបង្កើតឡើងដើម្បីបង្កើតជាផែនទីកំពូល ដែលអាចបង្ហាញវិចារណញាណអំពីស្ថានភាពនៃបំណែកផលិតផល PCR ។ដោយសារសីតុណ្ហភាពរលាយគឺជាតម្លៃ Tm នៃបំណែក DNA ប៉ារ៉ាម៉ែត្រមួយចំនួនដែលប៉ះពាល់ដល់តម្លៃ Tm នៃបំណែក DNA អាចត្រូវបានវិនិច្ឆ័យដូចជាទំហំបំណែក មាតិកា GC ជាដើម។ ជាទូទៅយោងទៅតាមគោលការណ៍រចនាបឋមរបស់យើងប្រវែងនៃផលិតផលពង្រីកគឺស្ថិតនៅក្នុងចន្លោះពី 80-300bp ដូច្នេះសីតុណ្ហភាពរលាយគួរតែមានចន្លោះពី 80°C និង 90°C។

ការបកស្រាយខ្សែកោងរលាយ៖ ប្រសិនបើកំពូលមេតែមួយគត់លេចឡើងនៅចន្លោះ 80°C-90°C វាមានន័យថា PCR បរិមាណ fluorescent គឺល្អឥតខ្ចោះ។ប្រសិនបើកំពូលភ្នំសំខាន់លេចឡើងនៅចន្លោះ 80 ° C-90 ° C និងកំពូលផ្សេងៗលេចឡើងក្រោម 80 ° C នោះ primer dimer ត្រូវបានពិចារណាជាមូលដ្ឋាន។អ្នកអាចព្យាយាមបង្កើនសីតុណ្ហភាព annealing ដើម្បីដោះស្រាយវា;ប្រសិនបើកំពូលភ្នំសំខាន់លេចឡើងនៅចន្លោះ 80°C-90°C ហើយកំពូលផ្សេងៗលេចឡើងម្តងទៀតនៅពេលសីតុណ្ហភាពកើនឡើង វាត្រូវបានគេចាត់ទុកថាជាមូលដ្ឋានថាមានការចម្លងរោគ DNA ហើយ DNA ចាំបាច់ត្រូវដកចេញនៅដំណាក់កាលដំបូងនៃការធ្វើពិសោធន៍។

ជាការពិតណាស់ នៅមានស្ថានភាពមិនប្រក្រតីមួយចំនួនទៀត ដែលនឹងត្រូវបំបែកម្តងមួយៗខាងក្រោម។
3. ចំណេះដឹងកម្រិតខ្ពស់

ដើម្បីធ្វើ qPCR ខ្ញុំត្រូវតែនិយាយថា MIQEព័ត៌មានអប្បបរមាសម្រាប់ការបោះពុម្ពផ្សាយបរិមាណPCR ពេលវេលាពិតការពិសោធន៍ - ព័ត៌មានអប្បបរមាសម្រាប់ការបោះពុម្ពផ្សាយអត្ថបទអំពី PCR បរិមាណពេលវេលាពិតប្រាកដការពិសោធន៍។ដើម្បីសម្រួលការយល់ដឹងរបស់អ្នកគ្រប់គ្នា យើងនឹងសម្រួលខ្លឹមសារសំខាន់ៗ។

អ្នកអាចស្វែងរកអត្ថបទដើមរបស់ MIQE នៅលើអ៊ីនធឺណិត ហើយអ្វីដែលសំខាន់បំផុតនោះគឺថាវាចែងអំពីបញ្ជីត្រួតពិនិត្យទិន្នន័យដែលត្រូវការផ្តល់ឱ្យនៅពេលបោះពុម្ពអត្ថបទ .

អ្នកត្រួតពិនិត្យអាចវិនិច្ឆ័យគុណភាពនៃការពិសោធន៍ដោយអានព័ត៌មានលម្អិតទាំងនេះ។អ្នកអាននាពេលអនាគតក៏អាចប្រើវាដើម្បីធ្វើឡើងវិញ ឬកែលម្អការពិសោធន៍ផងដែរ។
វាគួរឱ្យកត់សម្គាល់ថានៅក្នុងបញ្ជីនេះសារៈសំខាន់នៃបញ្ជីនីមួយៗត្រូវបានសម្គាល់ដោយ E ឬ D រៀងគ្នា។តើ​វា​មានន័យ​យ៉ាង​ដូចម្តេច?អ៊ី៖ ព័ត៌មានសំខាន់ៗ (ត្រូវតែដាក់ជូន);ឃ៖ ព័ត៌មានដែលចង់បាន (ផ្តល់ឲ្យច្រើនតាមតែអាចធ្វើទៅបាន)។

MIQE (1) - ការរចនាពិសោធន៍
មនុស្សឆោតល្ងង់ជាច្រើននាក់ដែលបានបញ្ចប់ការការពារខ្លួនបន្ទាប់ពីបញ្ចប់ការសិក្សាថ្នាក់បរិញ្ញាបត្រនឹងមិនដឹងពីរបៀបរចនាការពិសោធន៍ដោយឯករាជ្យ បើកសៀវភៅកត់ត្រារបស់ពួកគេ និងធ្វើអ្វីដែលគ្រូប្រាប់ពួកគេឱ្យធ្វើនោះទេ។ជាលទ្ធផល ការរចនាពិសោធន៍មិនមានភាពតឹងរ៉ឹងទេ ហើយផ្នែកវិចារណកថានៃទស្សនាវដ្តីបាននិយាយថា ពួកគេចង់បង្កើតរូបភាពនេះ និងរូបភាពនោះ ដូច្នេះហើយពួកគេបានធ្វើវាដោយភាពងឿងឆ្ងល់។នេះ​ជា​របៀប​នៃ​ការ​បោកប្រាស់​!

ខិតទៅជិតផ្ទះ គោលការណ៍ទីមួយនៃការពិសោធន៍គឺដើម្បីកំណត់ភាពតឹងរ៉ឹងនៃតក្កវិជ្ជាពិសោធន៍.មូលដ្ឋានគ្រឹះបំផុតគឺការរចនាពិសោធន៍ ហើយអ្វីដែលសំខាន់បំផុតនៃការរចនាពិសោធន៍គឺរបៀបកំណត់គំរូគោលដៅ គំរូយោង (ការគ្រប់គ្រង) និងចំនួនពាក្យដដែលៗ ដូច្នេះទិន្នន័យពិសោធន៍អាចយោង ប្រៀបធៀប និងជឿជាក់។

គំរូគោលដៅសំដៅទៅលើគំរូដែលតម្រូវឱ្យយើងរកឃើញហ្សែនគោលដៅបន្ទាប់ពីការព្យាបាលជាក់លាក់មួយ។គំរូយោងគឺ​ជា​គំរូ​ដោយ​មិន​មាន​ការ​ព្យាបាល​ណា​មួយ ដែល​ត្រូវ​បាន​គេ​ហៅ​ថា​ជា​ប្រភេទ​ព្រៃ​ក្នុង​ជីវវិទ្យា។

ការចម្លងសាកល្បងមានសារៈសំខាន់ណាស់។ជាទូទៅ ចំនួននៃការចម្លងដែលបញ្ចុះបញ្ចូលត្រូវតែមានច្រើនជាងបី។វាចាំបាច់ក្នុងការបែងចែកអ្វីដែលជាការចម្លងជីវសាស្រ្ត និងអ្វីដែលជាការចម្លងតាមបច្ចេកទេស។

ការចម្លងជីវសាស្ត្រ៖ ការ​ពិសោធន៍​ផ្ទៀងផ្ទាត់​ដូចគ្នា​ដែល​បាន​ធ្វើ​ជាមួយ​នឹង​វត្ថុធាតុ​ផ្សេង​គ្នា (ពេលវេលា, រុក្ខជាតិ, បាច់, ចាន​ប្រតិកម្ម)។

ការចម្លងជីវសាស្ត្រ
ចូរយើងលើកយកវិធីព្យាបាលសត្វល្អិតនៃម្រេចជាឧទាហរណ៍។យើងចង់បាញ់ថ្នាំសម្លាប់សត្វល្អិតលើរុក្ខជាតិទាំងបីរបស់ ABC បន្ទាប់មករុក្ខជាតិទាំងបីរបស់ ABC គឺជាការចម្លងជីវសាស្ត្រចំនួនបី ហើយពួកវាគឺជាការពិសោធន៍ផ្ទៀងផ្ទាត់ដូចគ្នាដែលធ្វើឡើងដោយវត្ថុធាតុផ្សេងៗគ្នា។ប៉ុន្តែជាការពិសោធន៍ ការត្រួតពិនិត្យគឺពិតជាត្រូវការ ដូច្នេះយើងអាចបាញ់មែកមួយនៃរុក្ខជាតិ A ដើម្បីបង្កើតជាក្រុមពិសោធន៍នៃរុក្ខជាតិ A និងមិនបាញ់ទៅលើមែកផ្សេងទៀតរបស់រុក្ខជាតិ A ដើម្បីបង្កើតជាក្រុមត្រួតពិនិត្យ។ធ្វើដូចគ្នាសម្រាប់ B និង C ។

ការចម្លងតាមបច្ចេកទេស (បច្ចេកទេសចម្លង)៖ វាគឺជាការពិសោធន៍ម្តងហើយម្តងទៀតដែលត្រូវបានរចនាឡើងដើម្បីជៀសវាងកំហុសដែលបណ្តាលមកពីប្រតិបត្តិការ ដែលតាមពិតគឺជារន្ធស្ទួនដែលរួមបញ្ចូលនៅក្នុងសម្ភារៈដូចគ្នា។ទាំងការព្យាបាល និងការគ្រប់គ្រងត្រូវតែមានការកំណត់ចម្លង (យ៉ាងហោចណាស់បី) នៃហ្សែនគោលដៅ និងហ្សែនយោងខាងក្នុង។

ពាក្យដដែលៗបច្ចេកទេស
យកម្រេចដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយថ្នាំសំលាប់សត្វល្អិតជាឧទាហរណ៍ម្តងទៀត។សម្រាប់ក្រុមពិសោធន៍នៃរុក្ខជាតិ A យើងបានបង្កើតរន្ធ PCR ចំនួន 3 នៃ 1, 2 និង 3 សម្រាប់ហ្សែនគោលដៅរបស់វា និងហ្សែនយោងខាងក្នុងរៀងៗខ្លួន ដើម្បីយកជាមធ្យមបន្ទាប់ពីការរកឃើញ។សម្រាប់ការគ្រប់គ្រងរុក្ខជាតិក្រុម A ក៏ត្រូវបានព្យាបាលតាមរបៀបដូចគ្នា។ដូចគ្នានេះដែរធ្វើការព្យាបាលដូចគ្នាសម្រាប់រុក្ខជាតិ B និង C ។នេះគឺជាពាក្យដដែលៗតាមបច្ចេកទេស។

វាគួរឱ្យកត់សម្គាល់ថាអ្វីដែលចូលទៅក្នុងស្ថិតិគឺការធ្វើឡើងវិញជីវសាស្រ្ត ហើយពាក្យដដែលៗបច្ចេកទេសគឺដើម្បីសាកល្បងថាតើមានបាតុភូតចៃដន្យណាមួយនៅក្នុងដំណើរការពិសោធន៍ ដើម្បីធ្វើឱ្យលទ្ធផលពិសោធន៍គួរឱ្យជឿជាក់ ពោលគឺដើម្បីជៀសវាងកំហុសដោយយកជាមធ្យមដូចដែលយើងតែងតែនិយាយ។

ការត្រួតពិនិត្យអវិជ្ជមាន - NTC និង NRT
NTC (ការគ្រប់គ្រងគ្មានគំរូ)វត្ថុបញ្ជាដោយគ្មានគំរូ ត្រូវបានប្រើដើម្បីផ្ទៀងផ្ទាត់ថាតើសម្ភារៈពិសោធន៍មានកខ្វក់ឬអត់។ជាទូទៅទឹកត្រូវបានប្រើជាគំរូ។ប្រសិនបើមានប្រតិកម្ម fluorescent វាបង្ហាញថាការចម្លងរោគអាស៊ីត nucleic បានកើតឡើងនៅក្នុងមន្ទីរពិសោធន៍។

ការបំពុលទាំងនេះបានមកពី៖ ទឹកមិនបរិសុទ្ធ សារធាតុដែលមិនមានលក្ខណៈសម្បត្តិគ្រប់គ្រាន់ដែលមាន DNA endogenous ការបំពុលបឋម ការបំពុលបរិក្ខារមន្ទីរពិសោធន៍ ការបំពុលដោយ aerosol ជាដើម ត្រូវប្រើឧបករណ៍រើសអេតចាយ RNase និង RNase inhibitors ។ការបំពុល Aerosol គឺពិបាករកបំផុត។ស្រមៃថាមន្ទីរពិសោធន៍របស់អ្នកគឺដូចជាផ្សែងអ័ព្ទ ដោយមានអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីកជាច្រើនត្រូវបានព្យួរនៅលើអាកាស។

NRT (No-Reverse Transcriptase)ការគ្រប់គ្រងដោយគ្មានប្រតិចារិកបញ្ច្រាសគឺជា RNA ដែលមិនបញ្ច្រាស់ជាការត្រួតពិនិត្យអវិជ្ជមាន ដែលជាការគ្រប់គ្រងនៃសំណល់ gDNA ។

នៅពេលធ្វើការបញ្ចេញហ្សែន បរិមាណ RNA ត្រូវបានរកឃើញដោយការរកឃើញបរិមាណ cDNA បន្ទាប់ពីការចម្លងបញ្ច្រាស។ប្រសិនបើមានសំណល់ gDNA នៅពេលដែល RNA ត្រូវបានបន្សុត វានឹងបង្កឱ្យមានកំហុសក្នុងលទ្ធផលពិសោធន៍ ព្រោះលទ្ធផលជាក់ស្តែងដែលទទួលបានគឺ gDNA និង cDNA ។នៅកម្រិតសរុប មិនមែនត្រឹមតែ cDNA ទេ gDNA ចាំបាច់ត្រូវដកចេញទាំងស្រុងកំឡុងពេលទាញយក RNA ។

MIQE (2) - ព័ត៌មានគំរូ
អ្វីដែលគេហៅថាព័ត៌មានគំរូមានន័យថានៅពេលយើងបោះពុម្ពអត្ថបទអំពី qPCR យើងត្រូវពន្យល់ព័ត៌មានគំរូយ៉ាងច្បាស់ ដែលជាផ្នែកមួយមិនអាចខ្វះបាននៃអត្ថបទ។ដូចគ្នានេះដែរ នៅពេលដែលយើងដំណើរការសំណាក យើងក៏ត្រូវតែគ្រប់គ្រងប្រតិបត្តិការរបស់យើងផងដែរ ដើម្បីធានាបាននូវសុពលភាពនៃគំរូ។

ការពិពណ៌នាអំពីគំរូគ្រាន់តែជាលទ្ធផលប៉ុណ្ណោះ ហើយយើងគួរតែយកចិត្តទុកដាក់បន្ថែមទៀតចំពោះសម្ភារៈដែលបានយកក្នុងអំឡុងពេលពិសោធន៍ទាំងមូល។

ការជ្រើសរើសសម្ភារៈពិសោធន៍
គំរូឈាម - ជ្រើសរើសឈាមស្រស់មិនលើសពី 4 ម៉ោង។សំណាកកោសិកា - ជ្រើសរើសដើម្បីប្រមូលកោសិកាស្រស់ៗក្នុងរយៈពេលនៃការលូតលាស់យ៉ាងខ្លាំងក្លា។ជាលិកាសត្វ - ជ្រើសរើសជាលិកាដែលលូតលាស់យ៉ាងរឹងមាំ។ជាលិការុក្ខជាតិ - ជ្រើសរើសជាលិកាវ័យក្មេងស្រស់។

អ្នក​ច្បាស់​ជា​បាន​កត់​សម្គាល់​ឃើញ​ថា​មាន​ពាក្យ​គន្លឹះ​ក្នុង​ប្រយោគ​មួយ​ចំនួន​នេះ៖ ស្រស់។
សម្រាប់សំណាកខាងលើ ឧបករណ៍ដ៏ល្អបំផុត មានប្រសិទ្ធភាព ចំណាយ និងស្ថេរភាពនៅលើទីផ្សារគឺឧបករណ៍ Foregene ដែលអាចទាញយក DNA និង RNA របស់ពួកគេបានយ៉ាងងាយស្រួល និងឆាប់រហ័ស។

កញ្ចប់ DNA ឈាមខ្នាតតូច

សំណុំកោសិកាដាច់ពីគ្នា RNA សរុប

ឧបករណ៍ញែក RNA សរុបរបស់សត្វ

Plant Total RNA Isolation Kit

Plant Total RNA Isolation Kit Plus

កញ្ចប់ DNA ដាច់ដោយឡែកពីរុក្ខជាតិ

ការផ្ទុកសម្ភារៈពិសោធន៍
និយាយជាទូទៅ យើងមិនណែនាំអោយរក្សាទុកគំរូទេ ប្រសិនបើលក្ខខណ្ឌអនុញ្ញាត។ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយ មានមិត្តភ័ក្តិជាច្រើនដែលមិនអាចធ្វើការពិសោធន៍ភ្លាមៗបន្ទាប់ពីការយកគំរូ ហើយអ្នកខ្លះថែមទាំងត្រូវយកធុងអាសូតរាវទៅកន្លែងសម្រាប់យកគំរូទៀតផង។

សម្រាប់​មិត្ត​ឧស្សាហ៍​ព្យាយាម​បែប​នេះ ខ្ញុំ​អាច​និយាយ​បាន​តែ​ថា អ្នក​មិន​យល់​ពី​គ្រឿង​ប្រើប្រាស់​ដែល​ប្រើ​សារធាតុ​ប្រតិកម្ម​ទេ។ឥឡូវនេះក្រុមហ៊ុនប្រើប្រាស់ reagent ជាច្រើនផលិត reagents ដែលអាចរក្សាទុកសំណាក RNA នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ ហើយអ្នកអាចជ្រើសរើសប្រើប្រាស់វាបាន។វិធីសាស្ត្រផ្ទុកធម្មតាគឺការផ្ទុកអាសូតរាវ ដោយប្រើធុងអាសូតរាវតូចមួយដែលងាយស្រួលយកតាមខ្លួន។បន្ទាប់​ពី​យក​សំណាក​មក​មន្ទីរ​ពិសោធន៍​វិញ​ហើយ សូម​ទុក​វា​ក្នុង​ទូទឹកកក -80°C។

សម្រាប់ការពិសោធន៍ពាក់ព័ន្ធនឹង RNA គោលការណ៍ប្រាំមួយពាក្យត្រូវតែអនុវត្តតាម៖សីតុណ្ហភាពទាប គ្មានអង់ស៊ីមនិងលឿន .

គំនិតនៃសីតុណ្ហភាពទាបគឺងាយស្រួលយល់;ដោយគ្មានអង់ស៊ីម RNase មាននៅគ្រប់ទីកន្លែងក្នុងពិភពលោកដែលយើងរស់នៅ (បើមិនដូច្នេះទេអ្នកនឹងត្រូវបានសម្លាប់ដោយមេរោគអេដស៍) ដូច្នេះរបៀបដើម្បីជៀសវាង RNase នៅពេលធ្វើការពិសោធន៍គឺជាគំនិតសំខាន់ណាស់។លឿនលើលោកនេះគ្មានកុងហ្វូណាដែលមិនអាចបំបែកបាន មានតែល្បឿនមិនអាចបំបែកបាន។.

ដូច្នេះក្នុងន័យមួយ ពេលវេលាទាញយកកាន់តែខ្លី ឧបករណ៍កាន់តែល្អ។ហេតុអ្វី?បុព្វបុរសឈុត​របស់​គេ​សង្កត់ធ្ងន់​លើ​ល្បឿន ព្រោះ​គេ​ដឹង​វា​ច្បាស់។

PS: ក្មេងស្រីខ្លះធ្វើការពិសោធន៍យ៉ាងប្រុងប្រយ័ត្ន ប៉ុន្តែពួកគេមិនសូវល្អដូច slam dunk បន្ទាប់ពីធ្វើការជាច្រើនឆ្នាំ។ពួកគេមានអារម្មណ៍ថាព្រះមិនយុត្តិធម៌ ត្អូញត្អែរពីអ្នកដទៃ និងស្វែងរកជីវិត។តាមពិតនាងមិនយល់ទេ។គាត់មិនបានការពារ RNA បានល្អទេ ហើយអ្នកលេង slam dunk មានភាពរហ័សរហួន។នៅពេលដែលគាត់កំពុងធ្វើការពិសោធន៍ គាត់គិតថាគាត់នឹងបញ្ចប់ slam dunk ដោយ 3 ដង 5 ដង និង 2 ដង ប៉ុន្តែគាត់បានធ្វើការពិសោធន៍បានយ៉ាងល្អ។

ចំណាំ៖ កាន់តែយឺត ឱកាសកាន់តែច្រើននៃការលុកលុយ RNase ។តើធ្វើដូចម្តេចដើម្បីហ្វឹកហាត់ខ្លួនឯងឱ្យលឿន?គ្មាន​ផ្លូវ​ទេ គ្រាន់​តែ​អនុវត្ត​បន្ថែម​ទៀត។

សម្រាប់ការពិសោធន៍ និងគំរូផ្សេងៗគ្នា វានៅតែចាំបាច់ក្នុងការអានអក្សរសិល្ប៍បន្ថែមទៀត ហើយជ្រើសរើសវិធីសាស្ត្រសមស្របមួយសម្រាប់ដំណើរការ។សម្រាប់ដំណើរការប្រមូល និងរក្សាទុកគំរូ MIQE តម្រូវឱ្យសរសេរយ៉ាងច្បាស់នៅក្នុងក្រដាស ដើម្បីឱ្យអ្នកត្រួតពិនិត្យអាចពិនិត្យមើលឡើងវិញនូវភាពជឿជាក់នៃក្រដាស ហើយវាក៏ងាយស្រួលសម្រាប់ក្មេងៗដែលស្រឡាំងកាំងក្នុងការធ្វើពិសោធន៍របស់អ្នកម្តងទៀត។

ថ្វីត្បិតតែការពិសោធន៍ជីវសាស្រ្តពិបាកក៏ដោយ ពួកគេមានកម្រិតខ្ពស់។ប្រសិនបើអ្នកមិនប្រយ័ត្ន អ្នកអាចក្រឡាប់ពិភពលោក។ជាឧទាហរណ៍ ការធ្វើឱ្យជំងឺ SARS ចូលទៅក្នុងវិបត្តិជីវគីមី ឬធ្វើស្រូវកូនកាត់ ដើម្បីជួយសង្រ្គោះមនុស្ស 1.3 ពាន់លាននាក់។រូបភាពខាងក្រោមគឺជាការពិសោធគីមី អ្នកគួរតែយល់ថាអ្នកមានមោទនភាពចំពោះការស្រាវជ្រាវរបស់អ្នក ដោយគ្រាន់តែមើលរូបរាងរបស់គាត់ដូចផ្លែដូង។បំភ្លេច​វា​ទៅ កុំ​ឲ្យ​គាត់​ខ្មៅ។

MIQE (3) - ការទាញយកអាស៊ីត nucleic ។
ការទាញយកអាស៊ីត nucleic គឺជាព្រឹត្តិការណ៍ដ៏ធំមួយ ហើយការពិសោធន៍ជីវវិទ្យាម៉ូលេគុលទាំងអស់ចាប់ផ្តើមជាមួយនឹងការទាញយកអាស៊ីត nucleic ។ជាដំបូងសូមចម្លងខ្លឹមសាររបស់ MIQE លើការទាញយកអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីក។

ក្រឡេកមើលទម្រង់នេះ អ្នកមិនអាចស្ថិតនៅលើផ្ទៃបានទេ។ទម្រង់បែបបទគឺជា dogma ។ដើម្បីក្លាយជាសិស្សកំពូល អ្នកត្រូវតែសួរថាហេតុអ្វី?ខ្លឹមសារសំខាន់នៃតារាងនេះគឺ៖ បន្តភាពបរិសុទ្ធ សុចរិតភាព ភាពជាប់លាប់ និងបរិមាណនៃការទាញយក RNA .

ផ្នែកដំបូងនៃអេដំណើរការ ឬឧបករណ៍ គឺជាជំហានទាញយកអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីក។ប្រសិនបើអ្នកប្រើឧបករណ៍ទាញយកអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីកដោយស្វ័យប្រវត្តិដើម្បីស្រង់ចេញ (កម្រិតខ្ពស់ សូមទាក់ទងខ្ញុំសម្រាប់ការទិញ) អ្នកត្រូវបង្ហាញឈ្មោះម៉ូដែលនៃឧបករណ៍។

ឈ្មោះរបស់ឧបករណ៍និង

តើឧបករណ៍អ្វីខ្លះត្រូវបានប្រើប្រាស់សម្រាប់ព័ត៌មានលម្អិតនៃការផ្លាស់ប្តូរ អ្វីដែលសារធាតុពិសេសត្រូវបានបន្ថែម ឬប្រតិបត្តិការពិសេសដែលត្រូវបានធ្វើឡើងគួរតែត្រូវបានពន្យល់យ៉ាងច្បាស់ ដើម្បីឲ្យអ្នកផ្សេងទៀតអាចធ្វើការពិសោធន៍របស់អ្នកម្តងទៀតបានយ៉ាងងាយស្រួល។

អ្នកខ្លះបន្ថែមសារធាតុពិសេសមួយចំនួននៅពេលស្រង់សំណាកពិសេស ដោយគិតថានេះជាអាវុធសម្ងាត់របស់ពួកគេ ហើយកុំប្រាប់អ្នកដទៃ។ខណៈពេលដែលរក្សាវាសម្ងាត់ ពួកគេក៏បាត់បង់ឱកាសដើម្បីធ្វើឱ្យអត្ថបទរបស់អ្នកភ្លឺផងដែរ។កុំឆ្លាត អ្នកត្រូវតែស្មោះត្រង់ជាងប្រទេសចាស់ Zhang ក្នុងការស្រាវជ្រាវវិទ្យាសាស្ត្រ បើអ្នកចង់ឆ្លាត អត្ថបទនឹងធ្វើឱ្យអ្នកល្ងង់។

ត្រូវតែចងចាំលេខផលិតផលរបស់ឧបករណ៍នៅពេលអ្នកបញ្ជាទិញកញ្ចប់ និងសរសេរអត្ថបទ។ជាទូទៅមានលេខពីរនៅលើកញ្ចប់៖ ឆ្មា - លេខកាតាឡុក (លេខផលិតផល លេខអត្ថបទ) លេខឡូត - លេខផលិតផល (ប្រើដើម្បីបង្ហាញថាតើផលិតផលមួយណាមកពីក្រុម)។

លើសពីនេះ លេខ CAS ត្រូវបានគេប្រើជាញឹកញាប់នៅពេលបញ្ជាទិញថ្នាំគីមីជីវៈ ហើយខ្ញុំនឹងផ្សព្វផ្សាយវាជាមួយគ្នា។លេខ CAS គឺជាលេខដែលផ្តល់ដោយសមាគមគីមីអាមេរិកដល់ថ្នាំគីមីថ្មីនីមួយៗ។ជាទូទៅ លេខបីត្រូវបានភ្ជាប់ដោយសញ្ញាចុច។លេខ CAS របស់ Rushui: 7732-18-5 ។សារធាតុគីមីច្រើនតែមានឈ្មោះក្លែងក្លាយច្រើន ប៉ុន្តែលេខ CAS គឺមានតែមួយគត់។នៅពេលបញ្ជាទិញថ្នាំ អ្នកអាចពិនិត្យលេខ CAS របស់វាជាមុនសិន។

ខិតទៅជិតផ្ទះ ហេតុអ្វីយើងត្រូវពណ៌នារឿងទាំងនេះឲ្យបានច្បាស់លាស់?តាមពិតទៅ វាក៏ជាការត្រួតពិនិត្យគុណភាពនៃការទាញយក RNA ផងដែរ។ការប្រើប្រាស់ឧបករណ៍ និងឧបករណ៍នឹងធ្វើឱ្យការទាញយក RNA កាន់តែស៊ីសង្វាក់គ្នា។មាត្រដ្ឋានស្រង់ចេញនៃមន្ទីរពិសោធន៍ធម្មតាមិនធំទេ ហើយវាអាចទទួលបានជាមួយឧបករណ៍។

ព័ត៌មានលម្អិតអំពីការព្យាបាល DNase ឬ RNase
បញ្ហាសំខាន់នៃ PCR បរិមាណ fluorescent គឺដើម្បីការពារការចម្លងរោគ DNA ហើយកុំពិសោធន៍ប្រសិនបើមានការចម្លងរោគ។ដូច្នេះ វាជាការចាំបាច់ក្នុងការបញ្ជាក់ពីដំណើរការដែលអ្នកបានប្រើដើម្បីដំណើរការ DNA ដើម្បីបង្ហាញថា DNA នៅក្នុងដំណើរការពិសោធន៍ត្រូវបានដកចេញទាំងស្រុង និងទាំងស្រុង។តំណាងដោយដ្យាក្រាម schematic ។

ដ្យាក្រាមគ្រោងការណ៍នៃ RNA និង DNA
ជាទូទៅ វិធីសាស្ត្រដក DNA គឺព្យាបាល RNA ជាមួយ DNase បន្ទាប់ពីស្រង់ចេញ។ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយ ទាំងនេះគឺជាវិធីសាស្ត្រចាស់។ឧបករណ៍ទាញយក RNA ពាណិជ្ជកម្មអាចយកចេញ DNA ក្នុងអំឡុងពេលដំណើរការទាញយកដោយមិនចាំបាច់បន្ថែម DNase ។ឧទាហរណ៍ ស៊េរីនៃកញ្ចប់ពី Foregene ។

ចំណាំ៖ ការដក DNA កំឡុងពេលទាញយក RNA គឺជាដាវមុខពីរដ៏គ្រោះថ្នាក់បំផុត ដែលនឹងពន្យារពេលវេលាប្រតិបត្តិការនៃការទាញយក RNA និងបង្កើនហានិភ័យនៃការរិចរិល RNA ។ជាទូទៅវាគឺជាការដោះដូររវាងទិន្នផល RNA និងភាពបរិសុទ្ធ។

លើសពីនេះ បរិមាណ DNase ដែលត្រូវបានបន្ថែមទៅក្នុងជួរឈរ adsorption ដែលមានមូលដ្ឋានលើ silica គឺតូចណាស់ ហើយ DNase ដែលមានគុណភាពខ្ពស់ត្រូវតែប្រើដើម្បីសម្រេចបាននូវប្រសិទ្ធភាព។DNase ដែលមិន​បាន​ធ្វើ​ឱ្យ​ប្រសើរ​មិន​អាច​ត្រូវ​បាន​រំលាយ​បាន​យ៉ាង​ឆាប់​រហ័ស​និង​ទាំង​ស្រុង។នេះ​ជា​ការ​សាកល្បង​កម្រិត​បច្ចេកទេស​របស់​អាជីវករ។ជាការពិតណាស់ មានឈ្មួញចំលែកជាច្រើនទៀតដែលមានអួតថា DNA អាចត្រូវបានយកចេញដោយគ្មាន DNase ។អាចនិយាយបានថា អ្នកណាដែលអួតថា DNA អាចត្រូវបានយកចេញទាំងស្រុងដោយគ្មាន DNase គឺជាមនុស្សទុច្ចរិត។DNA គឺជារចនាសម្ព័ន្ធខ្សែពីរដែលមានស្ថេរភាព ហើយវាមិនអាចត្រូវបានលុបចោលដោយគ្រាន់តែនិយាយ និងសើចនោះទេ។

ការវាយតម្លៃការបំពុល
វិធីសាស្ត្រវាយតម្លៃ៖ ការរកឃើញ electrophoresis, 1% agarose, 6V/cm, 15min, loading 1-3 ul

ការវិភាគបរិមាណអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីក
ជាធម្មតាត្រូវបានវាស់ដោយប្រើ spectrophotometer UV ។ខ្ញុំសូមលើកយកអត្ថន័យនៃតម្លៃទាំងបីនៃ OD260, OD280 និង OD230 ជាមុនសិន។
· OD260nm: វាគឺជារលកស្រូបទាញនៃកំពូលនៃការស្រូបយកខ្ពស់បំផុតនៃអាស៊ីត nucleic ហើយតម្លៃដែលវាស់វែងល្អបំផុតមានចាប់ពី 0.1 ដល់ 1.0។បើមិនដូច្នោះទេ ពនឺ ឬប្រមូលផ្តុំគំរូ ដើម្បីនាំវាទៅក្នុងជួរ។
· OD280nm: វាគឺជារលកស្រូបទាញនៃកម្រិតខ្ពស់បំផុតនៃការស្រូបយកប្រូតេអ៊ីន និងសារធាតុ phenolic ។
· OD230nm: វាគឺជារលកស្រូបទាញនៃកម្រិតខ្ពស់បំផុតនៃការស្រូបយកកាបូអ៊ីដ្រាត។

បន្ទាប់សូមនិយាយអំពីតួនាទីរបស់សូចនាករនីមួយៗ។សម្រាប់ A260 វាអាចត្រូវបានប្រើដើម្បីវាស់ទិន្នផលអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីក។នៅពេល OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml។

សម្រាប់ភាពបរិសុទ្ធ យើងត្រូវមើលសមាមាត្រដែលយើងឃើញជាទូទៅ៖ OD260/280 និង OD260/230។
· DNA សុទ្ធ៖ OD260/280 គឺប្រហែលស្មើនឹង 1.8។នៅពេលដែលវាធំជាង 1.9 វាបង្ហាញថាមានការបំពុល RNA ហើយនៅពេលដែលវាតិចជាង 1.6 វាបង្ហាញថាមានការបំពុលប្រូតេអ៊ីន និង phenol ។
· RNA សុទ្ធ៖ ១.៧
· OD260/230៖ មិនថាវាជា DNA ឬ RNA តម្លៃយោងគឺ 2.5។នៅពេលដែលវាតិចជាង 2.0 វាបង្ហាញថាមានការបំពុលនៃជាតិស្ករ អំបិល និងសារធាតុសរីរាង្គ។

ភាពសុចរិតនៃ RNA

វាមានសារៈសំខាន់ខ្លាំងណាស់ក្នុងការវាស់ស្ទង់ភាពសុចរិតនៃ RNA ។ជាទូទៅ វាចាំបាច់ក្នុងការធ្វើពិសោធន៍ RNA denaturation gel ដើម្បីពិនិត្យមើលថាតើពន្លឺរវាង 28S និង 18S RNA គឺជាទំនាក់ទំនងទ្វេរដង។នៅពេលដែលក្រុមទីបី 5S លេចឡើង វាមានន័យថា RNA បានចាប់ផ្តើមធ្លាក់ចុះ លើកលែងតែសត្វឆ្អឹងខ្នង។

ទិន្នន័យសម្រាប់ការវាយតម្លៃគុណភាព RNA៖ បន្ថែមពីលើការធ្វើតេស្តខាងលើ វាក៏មានការធ្វើតេស្តឧបករណ៍ទំនើបមួយចំនួនទៀតទាក់ទងនឹងភាពសុចរិតរបស់ RNA ដូចជាការធ្វើតេស្តភាពសុចរិត RQI នៃប្រព័ន្ធអេឡិចត្រូតស្វ័យប្រវត្ត Experion ដែលអាចរកឃើញថាតើ RNA ត្រូវបានបំផ្លាញដោយមើលមិនឃើញ។

នៅក្នុងការស្រាវជ្រាវវិទ្យាសាស្ត្រ PCR បរិមាណ fluorescent គឺជាការប្រៀបធៀបរវាងហ្សែនគោលដៅ និងហ្សែនយោងខាងក្នុង។ដូច្នេះ ក្នុង​ដំណើរ​ការ​នៃ​ការ​រក្សា​សំណាក RNA ការ​ទាញ​យក RNA ជាដើម គោលដៅ​ចម្បង​គឺ​ធានា​នូវ​ភាព​សុចរិត​នៃ RNA ។

របៀបដែលភាពសុចរិតនៃ RNA ប៉ះពាល់ដល់តុល្យភាពរវាងហ្សែនគោលដៅ និងហ្សែនយោងខាងក្នុងអាចយល់បានយ៉ាងងាយស្រួលពីរូបភាពខាងក្រោម។ការរិចរិលនឹងនាំទៅរកភាពមិនពេញលេញនៃហ្សែន មិនថាជាភាពមិនពេញលេញនៃហ្សែនយោងខាងក្នុង ឬភាពមិនពេញលេញនៃហ្សែនគោលដៅនោះទេ វានឹងមានឥទ្ធិពលយ៉ាងខ្លាំងទៅលើទិន្នន័យ។

ដ្យាក្រាមគ្រោងការណ៍នៃហ្សែនគោលដៅ និងហ្សែនយោង មិនត្រូវជាការពិតទេ។

ការធ្វើតេស្តទប់ស្កាត់ (ថាតើតម្លៃ CT ត្រូវបានបង្ក្រាបក្រោមកំហាប់ខ្ពស់ ឬទាប ឬលក្ខខណ្ឌផ្សេងទៀត)

ដោយយកតួលេខនេះជាឧទាហរណ៍ តម្លៃ Ct នៃខ្សែកោងទាំងប្រាំមានដូចខាងក្រោម។ការចែកចាយតម្លៃ CT រវាងខ្សែកោងគឺមិនស្មើគ្នា ហើយតម្លៃ Ct ត្រូវបានពន្យារពេលក្រោមកំហាប់ខ្ពស់ និងទាប ដែលជាករណីនៃការរារាំង PCR ។

ចំណុចសំខាន់៖ នៅក្នុងដំណើរការនៃការទាញយក RNA យើងត្រូវបោះបង់ការយល់ខុស និងបង្កើតអ្វីដែលត្រឹមត្រូវ។

គំនិតខុសគឺ៖ ការទាញយក RNA គ្រាន់តែបន្តទិន្នផល ដោយគិតថាបរិមាណ RNA ទទួលបានកាន់តែច្រើន កាន់តែប្រសើរ។តាមការពិត នៅពេលដែលយើងធ្វើបរិមាណ ប្រសិនបើចំនួនហ្សែនមិនច្រើនទេ យើងមិនត្រូវការ RNA ច្រើនទេ។បរិមាណ RNA ដែលអ្នកស្រង់ចេញគឺច្រើនជាងគ្រប់គ្រាន់។

គំនិតត្រឹមត្រូវគឺ៖ការទាញយក RNA គួរតែបន្តភាពបរិសុទ្ធ សុចរិតភាព និងស្ថិរភាព.ភាពបរិសុទ្ធអាចធានាថាការចម្លងបញ្ច្រាសជាបន្តបន្ទាប់មិនត្រូវបានរារាំងទេ ហើយទិន្នន័យនឹងមិនត្រូវបានប៉ះពាល់ដោយ DNA ទេ។សុចរិតភាពធានានូវតុល្យភាពនៃលំដាប់គោលដៅ និងឯកសារយោងផ្ទៃក្នុង។ភាពស៊ីសង្វាក់គ្នាធានានូវការផ្ទុកគំរូមានស្ថេរភាព។

MIQE (4) - ការចម្លងបញ្ច្រាស
ការយល់ខុស៖ ការស្វែងរកបរិមាណគំរូខ្ពស់ជាង។
គំនិតត្រឹមត្រូវ។៖ បន្តភាពស៊ីសង្វាក់គ្នា (ស្ថេរភាព) ដោយមិនគិតពីចំនួន RNA ដែលត្រូវបានផ្ទុក ប្រសិទ្ធភាពនៃការចម្លងបញ្ច្រាសនៅតែមានជាប់លាប់ ដោយធានាថាភាពខុសគ្នានៅក្នុង cDNA ពិតជាអាចឆ្លុះបញ្ចាំងពីភាពខុសគ្នានៅក្នុង mRNA ។
យើងពន្យល់ពីដំណើរការនេះជាមួយនឹងដ្យាក្រាមគ្រោងការណ៍៖

ដ្យាក្រាមគំនូសតាងនៃប្រសិទ្ធភាពប្រតិចារិកបញ្ច្រាស កុំជាការពិត
ជាដំបូង យើងត្រូវយល់ពីភាពខុសគ្នារវាងដំណើរការចម្លងបញ្ច្រាស និងដំណើរការ PCR ។PCR ឆ្លងកាត់ដំណើរការកំដៅ និង annealing ជាច្រើន ហើយបំណែកគោលដៅលូតលាស់អិចស្ប៉ូណង់ស្យែល។ខណៈ​ពេល​ដែល​ការ​ចម្លង​បញ្ច្រាស​មិន​មាន​ដំណើរ​ការ​នេះ យើង​អាច​ស្រមៃ​ថា​ការ​ចម្លង​បញ្ច្រាស​គឺ​ពិត​ជា​មួយ​ទៅ​មួយ​ក្នុង​អំឡុង​ពេល​ដំណើរ​ការ​ចម្លង​ដូច​ជា​បំណែក​ជាច្រើន​នៃ RNA

ដូចដែលមានអាចទទួលបានព័ត៌មាន cDNA ជាច្រើន វាគួរតែត្រូវបានយល់នៅពេលនេះ ដោយសារតែបំណែកធំ និងតូចត្រូវបានចម្លងបញ្ច្រាស ហើយវាមិនអាចទៅរួចទេក្នុងការផ្តោតលើបំណែកមួយ។ហើយដោយសារតែបរិមាណនៃ RNA មានតិចតួច បរិមាណ cDNA ដែលទទួលបានក៏មានតិចតួចផងដែរ មិនដូច PCR ដែលមានឥទ្ធិពលពង្រីក ដូច្នេះជាមូលដ្ឋានមិនអាចរកឃើញបានទេ។

លទ្ធផល electrophoresis cDNA
ទីពីរ តាមឧត្ដមគតិ ការចម្លងបញ្ច្រាសត្រូវបានអនុវត្តមួយទៅមួយ ប៉ុន្តែគ្មានការចម្លងបញ្ច្រាសពីក្រុមហ៊ុនណាមួយអាចសម្រេចបាននូវឥទ្ធិពលនេះទេ។ជាទូទៅ ប្រសិទ្ធភាពនៃប្រតិចារិកបញ្ច្រាសភាគច្រើនមានចន្លោះពី 30-50% ។ប្រសិនបើនេះជាករណី យើងចង់បានប្រសិទ្ធភាពនៃការចម្លងបញ្ច្រាសដែលមានស្ថេរភាព ដែលជាអ្វីដែលយើងចង់ឃើញក្នុងរូបភាព៖ 3 RNAs ទទួលបាន 2 cDNAs 6 RNAs ទទួលបាន 4 cDNA ដូច្នេះមិនថាសំណាកចំនួនប៉ុន្មានត្រូវបានផ្ទុក ប្រសិទ្ធភាពនៃការចម្លងបញ្ច្រាសគឺមានស្ថេរភាព។យើងមិនចង់ឃើញស្ថានភាពដែលប្រសិទ្ធភាពនៃការចម្លងបញ្ច្រាសមិនស្ថិតស្ថេរ ហើយកំហាប់ខ្ពស់ត្រូវបានរារាំង។

ដូច្នេះ​តើ​ធ្វើ​ដូចម្តេច​ដើម្បី​ផ្ទៀងផ្ទាត់​ថា​តើ​ប្រសិទ្ធភាព​ចម្លង​បញ្ច្រាស​មាន​ស្ថិរភាព​ឬ​ទេ?វិធីសាស្រ្តនេះគឺសាមញ្ញណាស់ អ្នកគ្រាន់តែត្រូវធ្វើការធ្វើតេស្តប្រៀបធៀបមួយប៉ុណ្ណោះ៖ មួយគឺការចម្លងបញ្ច្រាសទៅជា cDNA បន្ទាប់ពីការរំលាយ RNA ពីរដង ហើយមួយទៀតគឺធ្វើឱ្យការរំលាយទ្វេដងបន្ទាប់ពីការចម្លងបញ្ច្រាសទៅជា cDNA ហើយបន្ទាប់មកធ្វើ qPCR ដើម្បីមើលជម្រាលដែលទទួលបានថាតើវាស្របគ្នាដែរឬទេ។ក្នុងនាមជាសិស្សកំពូល អ្នកគួរតែយល់វាក្នុងរយៈពេលប៉ុន្មានវិនាទី។ដូចដែលបានបង្ហាញខាងក្រោម៖

ការរំលាយ RNA និង cDNA ដើម្បីសាកល្បងថាតើប្រសិទ្ធភាពនៃការចម្លងបញ្ច្រាសមានស្ថេរភាព
ប្រតិចារិកបញ្ច្រាស និងកញ្ចប់
របៀបដែល PCR បរិមាណ fluorescent ល្អឥតខ្ចោះមាន transcriptase បញ្ច្រាសដ៏ល្អ និងឧបករណ៍។Reverse transcriptase ត្រូវបានបែងចែកជាពីរប្រភេទយោងទៅតាមប្រភព AMV ឬM-MLVហើយការសម្តែងរបស់ពួកគេគឺដូចគ្នាទៅនឹងអ្វីដែលបានបង្ហាញក្នុងតារាង។

សកម្មភាព RNase H
RNase H គឺ Ribonuclease H ដែលជាឈ្មោះចិនគឺ ribonuclease H ដែលជា endoribonuclease ដែលអាចពិសេស hydrolyze RNA នៅក្នុងខ្សែសង្វាក់កូនកាត់ DNA-RNA ។RNase H មិនអាចរំលាយចំណង phosphodiester ក្នុង DNA ឬ RNA ខ្សែតែមួយ ឬពីរខ្សែបានទេ ពោលគឺវាមិនអាចរំលាយ DNA ឬ RNA ខ្សែតែមួយ ឬពីរខ្សែបានទេ។ត្រូវបានគេប្រើជាទូទៅក្នុងការសំយោគនៃ strand ទីពីរនៃ cDNA ។

វាជារឿងចម្លែក។យើងនិយាយថា reverse transcriptase មានសកម្មភាព RNase H មិនមែនថា reverse transcriptase មាន RNase H ទេ ហើយវាប្រហែលជាមិនអាចបំបែក RNase H ពី reverse transcriptase បានទេ ប្រហែលជាដោយសារតែការអនុលោមតាមក្រុមមួយចំនួននៅក្នុង reverse transcriptase សកម្មភាពនេះបណ្តាលមកពី reverse transcriptase ។

ដូច្នេះដោយមិនគិតពីប្រសិទ្ធភាពនៃការចម្លងបញ្ច្រាសខ្ពស់នៃ AMV សកម្មភាព RNase H របស់វាកាត់បន្ថយទិន្នផលនៃ cDNA ។ជាការពិតណាស់ក្រុមហ៊ុនផលិត reagent កំពុងបង្កើនប្រសិទ្ធភាពផលិតផលរបស់ពួកគេឥតឈប់ឈរដើម្បីលុបបំបាត់សកម្មភាព RNase H នៅក្នុង transcriptase បញ្ច្រាសតាមដែលអាចធ្វើទៅបានដើម្បីបង្កើនទិន្នផល cDNA ។
សីតុណ្ហភាពរលាយ

រចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំនៃ RNA នៅសីតុណ្ហភាពខុសគ្នា
សូមមើលរូបខាងលើសម្រាប់រចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំនៃ RNA នៅសីតុណ្ហភាពខុសៗគ្នា ហើយប្រើឧបករណ៍អនឡាញ mFold ដើម្បីកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំនៃបំណែកគោលដៅក្រោមលក្ខខណ្ឌសីតុណ្ហភាពជាក់លាក់ និងកំហាប់អំបិល។នៅ 55 ° C រចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំនៃ RNA នៅតែស្មុគ្រស្មាញខ្លាំង បញ្ច្រាស transcriptase មិនអាចដំណើរការបានទេហើយរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំមិនអាចដោះស្រាយបានទាំងស្រុងរហូតដល់ 65 ° C ខណៈពេលដែលសីតុណ្ហភាពល្អបំផុតនៃ AMV និង M-MLV គឺទាបជាងសីតុណ្ហភាពនេះ។
អ្វី​ដែល​ត្រូវធ្វើ?រចនាសម្ព័នបន្ទាប់បន្សំគឺជាការផ្គូផ្គងបំពេញបន្ថែមនៃគំរូខ្លួនវា ដែលនាំឱ្យមានការប្រកួតប្រជែងខ្លាំងរវាង primer និង reverse transcriptase និង template ដែលបណ្តាលឱ្យមានបញ្ហាជាបន្តបន្ទាប់ដូចជា E ទាប និងអាចធ្វើឡើងវិញបានខ្សោយ។

អ្វី​ដែល​ត្រូវធ្វើ?គ្រាន់តែបង្កើនសីតុណ្ហភាព annealing ឱ្យបានច្រើនតាមដែលអាចធ្វើទៅបាន។

ក្រុមហ៊ុនផលិត reagent ជាច្រើនកំពុងកែលម្អ transcriptase បញ្ច្រាសរបស់ពួកគេតាមរយៈវិស្វកម្មហ្សែន។ខ្លះបង្កើនសីតុណ្ហភាពប្រតិកម្មដូចជា Jifan និង Aidelai ហើយខ្លះទៀតដកក្រុមសកម្មនៃអង់ស៊ីម RNase H ដើម្បីកែលម្អភាពស្និទ្ធស្នាលរវាងអង់ស៊ីម និងគំរូ RNA ។ភាពស្និទ្ធស្នាលខ្ពស់អាចប្រកួតប្រជែងបំបែករចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំ និងអានបានយ៉ាងរលូន ហើយថែមទាំងធ្វើអោយប្រសើរឡើងយ៉ាងខ្លាំងនូវប្រសិទ្ធភាពនៃការចម្លងបញ្ច្រាស។
ចំណុចសំខាន់៖ ការចម្លងបញ្ច្រាសគឺមានសារៈសំខាន់ជាងដើម្បីបន្តភាពស៊ីសង្វាក់នៃប្រសិទ្ធភាពនៃការចម្លងបញ្ច្រាស (អង់ស៊ីមមិនត្រឹមតែមានប្រសិទ្ធភាពប៉ុណ្ណោះទេ ថែមទាំងមានស្ថេរភាពផងដែរ) ជាជាងបរិមាណនៃគំរូដែលបានផ្ទុក ប្រសិនបើវាមិនមែនជា PCR បរិមាណ fluorescent ខ្នាតធំពិសេសនោះ វានឹងមិនអាចទៅរួចទេទាំងអស់។cDNAs ច្រើន។
ក្រុមហ៊ុនផលិតផ្សេងៗក៏បានខិតខំប្រឹងប្រែងមួយចំនួនក្នុងការស្វែងរកភាពស៊ីសង្វាក់គ្នាផងដែរ។ជាឧទាហរណ៍ ក្រុមហ៊ុនភាគច្រើនឥឡូវនេះបានវេចខ្ចប់ការចម្លងបញ្ច្រាសជាឧបករណ៍ស្តង់ដារសម្រាប់លក់ ដែលជាជម្រើសដ៏ល្អ។
ឧទាហរណ៍ ឧបករណ៍ RT Easy Series របស់ Foregene៖

RT Easy I (Master premix សម្រាប់ឧបករណ៍សំយោគ cDNA strand ដំបូង)

MIQE (5) - ព័ត៌មានហ្សែនគោលដៅ

តួលេខខាងលើពន្យល់
1. ថាតើហ្សែននេះមានប្រសិទ្ធភាពសម្រាប់ការពិសោធន៍ម្តងហើយម្តងទៀត ជាទូទៅអាចត្រូវបានផ្ទៀងផ្ទាត់ដោយការពិសោធន៍ម្តងហើយម្តងទៀត។
2. ហ្សែន ID អ្នកដឹងហើយ។
3. ប្រវែងហ្សែន ប្រវែងសរុបនៃហ្សែនគោលដៅគឺពិតជាគ្មានបញ្ហាទេ។នៅពេលរចនា primers ត្រូវប្រាកដថាប្រវែងនៃ amplicon ស្ថិតនៅចន្លោះ 80-200bp ដើម្បីធានាបាននូវប្រសិទ្ធភាព amplification កាន់តែប្រសើរ។
4. ព័ត៌មានប្រៀបធៀបការផ្ទុះជាលំដាប់ ហ្សែនគោលដៅចាំបាច់ត្រូវប្រៀបធៀបនៅក្នុង genebank ដើម្បីការពារការពង្រីកមិនជាក់លាក់។
5. វត្តមាន pseugenes ។pseudogene គឺជាលំដាប់ DNA ស្រដៀងទៅនឹងហ្សែនធម្មតា ប៉ុន្តែបាត់បង់មុខងារធម្មតារបស់វា។ជារឿយៗវាមាននៅក្នុងគ្រួសារពហុហ្សែននៃ eukaryotes ។ជាធម្មតាវាត្រូវបានតំណាងដោយ ψ ។វាគឺជាការចម្លង DNA ហ្សែនដែលមិនមានមុខងារនៅក្នុង genome ដែលស្រដៀងទៅនឹងលំដាប់ហ្សែនកូដ។ជាទូទៅមិនត្រូវបានចម្លង និងមិនមានអត្ថន័យសរីរវិទ្យាច្បាស់លាស់។
6. ទីតាំងនៃ primers ទាក់ទងទៅនឹង exons និង introns ។នៅដើមឆ្នាំដំបូង នៅពេលដែលយើងដោះស្រាយបញ្ហានៃការចម្លងរោគ DNA យើងតែងតែយកចិត្តទុកដាក់លើទីតាំងនៃ primers, exons, និង introns ហើយជាទូទៅត្រូវបានពិចារណាលើការរចនា primers ឆ្លងកាត់ introns ដើម្បីជៀសវាងការពង្រីក DNA ។សូមមើលរូបខាងក្រោម៖ ខ្មៅតំណាងឱ្យ introns, ពណ៌ខៀវជាច្រើនតំណាងឱ្យ exons, ពណ៌ផ្កាឈូកតំណាងឱ្យ primers ទូទៅ, និងពណ៌ក្រហមភ្លឺតំណាងឱ្យ primer-spanning ។

គ្រោងការណ៍, មិនពិត
នេះគឺជាផែនការដ៏ល្អឥតខ្ចោះមួយ ប៉ុន្តែតាមពិតទៅ ក្នុងករណីភាគច្រើន សារធាតុប្រេស៊ីស អ៊ីនត្រូន មិនមានវេទមន្តដូចការគិតនោះទេ ហើយពួកវាក៏នឹងធ្វើឱ្យមានការពង្រីកមិនជាក់លាក់ផងដែរ។ដូច្នេះ​វិធី​ដ៏​ល្អ​បំផុត​ក្នុង​ការ​ការពារ​ការ​ចម្លងរោគ DNA គឺ​ត្រូវ​យក DNA ចេញ​ទាំងស្រុង។
7. ការព្យាករណ៍ការអនុលោមភាព។ដោយប្រើឧទាហរណ៍នេះម្តងទៀត ប្រើឧបករណ៍អនឡាញ mFold ដើម្បីកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំនៃបំណែកគោលដៅនៅសីតុណ្ហភាពជាក់លាក់ និងកំហាប់អំបិល។

រចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំនៃ RNA នៅសីតុណ្ហភាពខុសគ្នា
រចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំគឺជាការផ្គូផ្គងបំពេញបន្ថែមនៃគំរូខ្លួនវា ដែលនឹងនាំឱ្យមានការប្រកួតប្រជែងខ្លាំងរវាងការផ្គូផ្គង primer និង template ហើយឱកាសនៃការចង primer គឺតិចជាង ដែលបណ្តាលឱ្យមានបញ្ហាជាបន្តបន្ទាប់ដូចជា E ទាប និងអាចធ្វើឡើងវិញបានខ្សោយ។តាមរយៈការទស្សន៍ទាយផ្នែកទន់ ប្រសិនបើមិនមានបញ្ហារចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំទេ នោះពិតជាល្អណាស់។ប្រសិនបើមាន អត្ថបទបន្ទាប់របស់យើងនឹងពិភាក្សាជាពិសេសអំពីរបៀបដោះស្រាយបញ្ហានេះ។

MIQE (6)-qPCR Oligonucleotides

សម្រាប់ PCR បរិមាណ fluorescent រឿងដំបូងដែលអ្នកតស៊ូជាមួយរាល់ថ្ងៃគឺការទាញយក RNA ហើយរឿងទីពីរអាចជាការរចនាបឋម។
ជាដំបូងយើងនៅតែពិនិត្យមើលច្បាប់អំពីការរចនា primer យោងតាមបញ្ជីត្រួតពិនិត្យ MIQE ។វាសាមញ្ញណាស់ដែលមនុស្សចំអកអាចសើច ហើយយើងអាចបញ្ចប់វាក្នុងមួយប្រយោគ៖ ស្វែងយល់ពីលំដាប់ និងទីតាំងនៃការស៊ើបអង្កេតបឋម និងវិធីសាស្ត្រកែប្រែ។សម្រាប់វិធីសាស្ត្របន្សុតបឋម ការសំយោគបឋមមានតម្លៃថោកណាស់នាពេលបច្ចុប្បន្ន qPCR មានភាពសក្ដិសមនៃ PAGE និងវិធីបន្សុតខាងលើ ហើយព័ត៌មាននៃឧបករណ៍សំយោគមិនសំខាន់ទេ។មនុស្សជាច្រើនបានធ្វើ primers ជាច្រើនទសវត្សរ៍មកហើយ ហើយមិនដឹងថាឧបករណ៍សំយោគគឺ ABI3900 ទេ។
ទាក់ទងនឹងគោលការណ៍នៃការរចនា primer អ្នកមិនចាំបាច់ទន្ទេញវាដោយ rote ទេ ព្រោះកម្មវិធីរចនា primer ឬឧបករណ៍អនឡាញភាគច្រើនអាចដោះស្រាយបញ្ហាទាំងនេះបាន (ណែនាំឧបករណ៍អនឡាញ primer3.ut.ee/) ហើយ 99.999% នៃការរចនា primer មិនត្រូវបានធ្វើដោយដៃមើលទេ ពេលខ្លះអ្នកនិពន្ធបង្កើត primer រាប់រយក្នុងមួយថ្ងៃ បើអ្នកអានម្តងមួយៗ វានឹងក្លាយទៅជា។
គ្រាន់តែពិនិត្យមើលចំណុចខាងក្រោមបន្ទាប់ពី primers ត្រូវបានរចនាឡើង:
1. ការរចនា primers នៅជិតចុង 3′៖ នៅក្នុងករណីនៃការប្រើប្រាស់ oligo dT primers សម្រាប់ការសំយោគនៃ cDNA first-strand ដោយពិចារណាលើប្រសិទ្ធភាពនៃការចម្លងបញ្ច្រាស និង RNA integrity នោះ primers ដែលបានរចនាត្រូវរចនានៅជិតចុង 3′ ដើម្បីបង្កើនប្រសិទ្ធភាព amplification ។ប្រើរូបភាពដើម្បីពន្យល់ដូចខាងក្រោម (មិនមានវិធីដើម្បីយល់ពីនេះទេ)៖

ហេតុអ្វីបានជា primers គួរតែត្រូវបានរចនានៅជិតចុង 3′ វាមិនត្រូវជាការពិតទេ។
2. តម្លៃ TM៖ តម្លៃ Tm គឺនៅសីតុណ្ហភាព 55-65°C (ព្រោះសកម្មភាព exonuclease ខ្ពស់បំផុតនៅ 60°C) ហើយមាតិកា GC គឺនៅ 40%-60%។
3. BLAST៖ ដើម្បីជៀសវាងការពង្រីកមិនជាក់លាក់នៃហ្សែននោះ Blast ត្រូវតែប្រើសម្រាប់ការផ្ទៀងផ្ទាត់បន្ថែម។

MIQE (7) - ដំណើរការ qPCR

1. ឧបករណ៍ qPCR
យោងតាមតម្រូវការរបស់ MIQE យើងត្រូវពណ៌នាយ៉ាងច្បាស់អំពីលក្ខខណ្ឌប្រតិកម្មពេញលេញនៅក្នុងអត្ថបទ រួមទាំងការកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធនៃប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម PCR តើឧបករណ៍ប្រើប្រាស់អ្វីខ្លះ តើអ្នកណាជាអ្នកផលិត ប្រព័ន្ធប្រតិកម្មមានទំហំប៉ុនណា ថាតើវិធីសាស្ត្រជ្រលក់ពណ៌ ឬវិធីសាស្ត្រស៊ើបអង្កេតត្រូវបានប្រើ ការកំណត់កម្មវិធី PCR ។អ្នកបើកបរជើងចាស់នឹងយល់ច្បាស់ថា ដរាបណាឧបករណ៍ត្រូវបានជ្រើសរើស ព័ត៌មានខាងលើត្រូវបានកំណត់ជាមូលដ្ឋាន។
នាពេលបច្ចុប្បន្ននេះ ការផលិត និងផលិតឧបករណ៍ PCR បរិមាណ fluorescent គឺជាបច្ចេកវិទ្យាចាស់ទុំណាស់។ដរាបណាអ្នកមិនជ្រើសរើសក្រុមហ៊ុនផលិតដែលអាក្រក់ខ្លាំង ប្រូបាប៊ីលីតេនៃបញ្ហាគឺមិនខ្ពស់ទេ ប៉ុន្តែយើងនៅតែចង់ចែករំលែកជាមួយអ្នកនូវចំណុចមួយចំនួន៖
អង់ស៊ីម Taq ចាប់ផ្តើមក្តៅ៖ផ្នែកសំខាន់បំផុតនៃ PCR គឺអង់ស៊ីម Taq ចាប់ផ្តើមក្តៅ។អង់ស៊ីមចាប់ផ្តើមក្តៅនៅលើទីផ្សារជាទូទៅត្រូវបានបែងចែកទៅជាពីរប្រភេទ មួយគឺជាអង់ស៊ីមចាប់ផ្តើមក្តៅដែលត្រូវបានកែប្រែដោយគីមី (អ្នកអាចស្រមៃថាវាដូចជាការបង្កប់ប៉ារ៉ាហ្វីន) និងមួយទៀតគឺជាអង់ស៊ីមចាប់ផ្តើមក្តៅសម្រាប់ការកែប្រែអង្គបដិបក្ខ (អង់ទីហ្សែន - អង់ទីប៊ីយ៉ូចងភ្ជាប់) ។ការកែប្រែគីមីគឺជាវិធីដំបូងនៃអង់ស៊ីមចាប់ផ្តើមក្តៅ។នៅពេលដែលសីតុណ្ហភាពជាក់លាក់មួយត្រូវបានឈានដល់ អង់ស៊ីមនឹងបញ្ចេញសកម្មភាពរបស់វា។អង់ស៊ីម hot-start កែប្រែអង្គបដិប្រាណ ប្រើវិធីសាស្ត្រជីវសាស្ត្រ ដើម្បីទប់ស្កាត់សកម្មភាពរបស់អង់ស៊ីម។នៅពេលដែលសីតុណ្ហភាពជាក់លាក់មួយត្រូវបានឈានដល់ អង្គបដិបក្ខនឹងប្រែពណ៌ និងអសកម្មជាប្រូតេអ៊ីន ហើយសកម្មភាពអង់ស៊ីមនឹងត្រូវបាននាំយកទៅក្នុងសកម្មភាព។

ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយតើវាមានប្រយោជន៍អ្វី?នេះជាករណី សកម្មភាពបញ្ចេញអង់ស៊ីមដែលបានកែប្រែអង្គបដិប្រាណគឺលឿនជាងអង់ស៊ីមដែលបានកែប្រែគីមី ដូច្នេះបើនិយាយពីភាពប្រែប្រួល អង់ស៊ីមដែលបានកែប្រែអង្គបដិប្រាណមានអត្ថប្រយោជន៍បន្តិចបន្តួច ដូច្នេះមិនមានអង់ស៊ីមកែប្រែគីមីជាមូលដ្ឋាននៅក្នុងកញ្ចប់នៅលើទីផ្សារទេ។ប្រសិនបើមាន នោះបច្ចេកវិទ្យារបស់អ្នកផលិតនេះនៅតែជាប់គាំងក្នុងយុគសម័យសហស្សវត្សរ៍។
កំហាប់អ៊ីយ៉ុងម៉ាញ៉េស្យូម៖កំហាប់អ៊ីយ៉ុងម៉ាញ៉េស្យូមមានសារៈសំខាន់ខ្លាំងណាស់នៅក្នុងប្រតិកម្ម PCR ។កំហាប់អ៊ីយ៉ុងម៉ាញេស្យូមសមស្របអាចជំរុញការបញ្ចេញសកម្មភាពអង់ស៊ីម Taq ។ប្រសិនបើការផ្តោតអារម្មណ៍គឺទាបពេក, សកម្មភាពអង់ស៊ីមនឹងត្រូវបានកាត់បន្ថយយ៉ាងខ្លាំង;ប្រសិនបើកំហាប់ខ្ពស់ពេក អង់ស៊ីម-កាតាលីករ ពង្រីកមិនជាក់លាក់នឹងត្រូវបានពង្រឹង។កំហាប់នៃអ៊ីយ៉ុងម៉ាញេស្យូមក៏នឹងប៉ះពាល់ដល់ការស្រោបនៃសារធាតុ primers សីតុណ្ហភាពរលាយនៃគំរូ និងផលិតផល PCR ដោយហេតុនេះប៉ះពាល់ដល់ទិន្នផលនៃបំណែកដែលពង្រីក។កំហាប់នៃអ៊ីយ៉ុងម៉ាញ៉េស្យូមជាទូទៅត្រូវបានគ្រប់គ្រងនៅ 25mM ។ជាការពិតណាស់សម្រាប់ឧបករណ៍ដ៏ល្អ ការប្រមូលផ្តុំនៃអ៊ីយ៉ុងម៉ាញេស្យូមត្រូវតែត្រូវបានគ្រប់គ្រងយ៉ាងល្អ។ឈ្មួញខ្លះបន្ថែមសារធាតុ chelating អ៊ីយ៉ុងម៉ាញេស្យូម ទៅនឹងសារធាតុប្រតិកម្ម ដែលអាចសម្រេចបាននូវឥទ្ធិពលនៃការកែតម្រូវដោយស្វ័យប្រវត្តិនៃកំហាប់អ៊ីយ៉ុងម៉ាញេស្យូម។
កំហាប់សារធាតុ fluorescent៖ថ្នាំលាប fluorescent ដែលជា SYBR Green ដែលយើងប្រើជាធម្មតា បង្កើតជាចំបងនូវ fluorescence ដោយភ្ជាប់ទៅនឹងចង្អូរអនីតិជននៃ DNA ពីរខ្សែ ពីព្រោះការចងថ្នាំជ្រលក់ទៅនឹង DNA ពីរខ្សែគឺមិនជាក់លាក់ទេ មានន័យថា ដរាបណា DNA ខ្សែពីរត្រូវបានផ្សំជាមួយវា នោះ fluorescence នឹងកើតឡើងក្នុងទម្រង់ជាប្រព័ន្ធ DNA ។ សញ្ញា។
PS: ដោយសារតែលក្ខណៈសម្បត្តិងាយនឹងពន្លឺរបស់វា ផលិតផលនៅលើទីផ្សារជាទូទៅត្រូវបានខ្ចប់នៅក្នុងបំពង់ centrifuge ពណ៌ត្នោតស្រអាប់ (ដូចបង្ហាញក្នុងរូបភាពខាងក្រោម)។ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយវានឹងជួបប្រទះបញ្ហា។វាពិបាកក្នុងការមើលថាតើអង្គធាតុរាវត្រូវបានបឺតនៅពេលយកសំណាក។ក្នុងន័យនេះ Qingke គឺពិតជាងាយស្រួលប្រើបំផុត (ដូចបង្ហាញក្នុងរូបភាពខាងក្រោម) ហើយបំពង់ថ្លាត្រូវបានខ្ចប់ក្នុងថង់សំណប៉ាហាំងស្រអាប់។បន្ទាប់មកដាក់វាចូលទៅក្នុងថង់សំណប៉ាហាំងដោយគិតគូរពីភាពងាយស្រួលនៃការជៀសវាងពន្លឺនិងគំរូ។អ្នកត្រូវតែជ្រើសរើសលេខផលិតផលត្រឹមត្រូវ។TSE204 គឺជាអត្ថិភាពដែលមានប្រសិទ្ធភាពខ្ពស់ ដែលធ្វើឱ្យខ្ញុំចង់ដាំស្មៅ។

កំហាប់នៃសារធាតុ fluorescent ក៏មានសារៈសំខាន់ផងដែរ។ប្រសិនបើកំហាប់ទាបពេក ខ្សែកោង amplification នឹងមិនឡើងក្នុងដំណាក់កាលក្រោយ ហើយមិនល្អឥតខ្ចោះ។ប្រសិនបើកំហាប់ខ្ពស់ពេក វានឹងធ្វើឱ្យមានការរំខានដោយសំឡេង។ដោយសារ PCR បរិមាណ fluorescent ពឹងផ្អែកជាចម្បងលើតម្លៃ CT ប្រសិនបើកំហាប់នៃសារធាតុ fluorescent dye មិនត្រូវបានកែតម្រូវត្រឹមត្រូវ នោះចំណុចទាបគឺល្អជាងចំណុចខ្ពស់។ជាការពិតណាស់ការប្រមូលផ្តុំថ្នាំជ្រលក់ដែលសមស្របគឺល្អបំផុត។

ROX៖ ថ្នាំជ្រលក់ ROX ត្រូវបានប្រើដើម្បីកែកំហុសនៃសញ្ញា fluorescence យ៉ាងល្អ។ក្រុមហ៊ុនផលិតឧបករណ៍មួយចំនួនទាមទារការក្រិតតាមខ្នាត ខណៈពេលដែលអ្នកផ្សេងទៀតមិនមាន។ឧទាហរណ៍ ការប្រើប្រាស់ឧបករណ៍ពង្រីក PCR ពេលវេលាពិតរបស់ Thermo Fisher Scientific ជាធម្មតាតម្រូវឱ្យមានការក្រិតតាមខ្នាត រួមទាំង 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus ជាដើម។ ការណែនាំអំពីកញ្ចប់ទូទៅនឹងពណ៌នាអំពីវា។
qPCR Mix របស់ Foregene ក៏មានសារធាតុជ្រលក់ ROX ដែលងាយស្រួលប្រើក្នុងម៉ូដែលផ្សេងៗ។

ពេលវេលាពិត PCR Kit-Taqman

ការព្យាបាលចំណងអ៊ីដ្រូសែនខ្សោយ៖ ការព្យាបាលចំណងអ៊ីដ្រូសែនខ្សោយគឺជាបញ្ហាបច្ចេកទេស។គ្មានអ្វីដែលបានអានសៀវភៅណែនាំអំពីឧបករណ៍ជាច្រើននោះទេ ប៉ុន្តែគ្មាននរណាម្នាក់ក្នុងចំណោមពួកគេនិយាយអំពីប្រធានបទនេះទេ។តាមការពិតវាមានសារៈសំខាន់ណាស់។ការរួមបញ្ចូលគ្នានៃមូលដ្ឋានភាគច្រើនអាស្រ័យលើកម្លាំងនៃចំណងអ៊ីដ្រូសែន។ចំណងអ៊ីដ្រូសែនខ្លាំងគឺជាការពង្រីកធម្មតា ហើយចំណងអ៊ីដ្រូសែនខ្សោយនាំទៅរកការពង្រីកមិនជាក់លាក់។ប្រសិនបើចំណងអ៊ីដ្រូសែនខ្សោយមិនអាចលុបចោលបានល្អទេ ការពង្រីកមិនជាក់លាក់មិនអាចជៀសវាងបានទេ។នៅក្នុងវិសាលភាពនៃអ្នកនិពន្ធ មានតែក្រុមហ៊ុនមួយចំនួនប៉ុណ្ណោះដែលបានកត់សម្គាល់បញ្ហានេះ។នៅពេលអ្នកទិញឧបករណ៍ អ្នកអាចយោងទៅថាតើអ្នកបានពិចារណាដំណោះស្រាយក្នុងរឿងនេះសម្រាប់ឧបករណ៍ដែលអ្នកចង់ជ្រើសរើសឬអត់។

បរិមាណប្រតិកម្ម: ប្រព័ន្ធ 20-50ul ត្រូវបានគេប្រើច្រើនជាងធម្មតា ហើយបរិមាណតូចជាងទំនងជាបង្កឱ្យមានកំហុស។និយាយជាទូទៅ ការណែនាំអំពីកញ្ចប់នឹងណែនាំការប្រើប្រាស់បរិមាណប្រតិកម្ម PCR ។កុំឆ្លាត ហើយប្រើទំហំតូចជាងមុន ដើម្បីសន្សំការចំណាយ។គោលដៅរបស់។បរិមាណដែលបានណែនាំដោយពាណិជ្ជករពិតជាត្រូវបានសាកល្បង ហើយវាអាចថាពួកគេមិនអាចដោះស្រាយបញ្ហានៃកំហុសដែលបណ្តាលមកពីបរិមាណតូច។
2. ក្រុមហ៊ុនផលិតនិងលេខអត្ថបទនៃចានបំពង់
មនុស្សគ្រប់គ្នាដឹងពីគោលការណ៍នៃ PCR បរិមាណ fluorescent ។ការប្រមូលផ្តុំហ្វ្លុយអូរីសត្រូវបានអនុវត្តជាចម្បងតាមរយៈមួកបំពង់ PCR ។នៅពេលជ្រើសរើសឧបករណ៍ប្រើប្រាស់ PCR សូមយកចិត្តទុកដាក់លើចំណុចពីរ៖ ការបញ្ជូនពន្លឺល្អ និងសមរម្យសម្រាប់ឧបករណ៍។និយាយជាទូទៅ ក្តារ និងបំពង់នៃម៉ាកល្បីៗគឺល្អ ប៉ុន្តែអ្នកត្រូវជ្រើសរើសដោយប្រុងប្រយ័ត្នក្នុងលក្ខខណ្ឌនៃការសម្របខ្លួន បើមិនដូច្នេះទេអ្នកនឹងមិនអាចប្រើឧបករណ៍បានទេ។

4. ចំណេះដឹងកម្រិតកំពូល

MIQE (8)-qPCR សុពលភាព
នេះជាអាទិភាពចម្បងរបស់ qPCR!វីរបុរសជាច្រើនបានធ្លាក់ចូលទៅក្នុងដីខ្សាច់នៅទីនេះ។ជាការពិតណាស់ វាក៏អាចទៅរួចដែលអ្នកមានសំណាង ហើយហ្សែនដែលអ្នកបានសិក្សាគឺសាមញ្ញ ដូច្នេះអ្នកបានអណ្តែតតាមរូងភ្នំទឹកកកតាមខ្យល់។ព័ត៌មានផ្ទៀងផ្ទាត់របស់ qPCR មានគោលបំណងសាកល្បងភាពជឿជាក់នៃទិន្នន័យ។យើងរាយបញ្ជីព័ត៌មានផ្ទៀងផ្ទាត់ចាំបាច់ដូចខាងក្រោម៖

1. ការធ្វើតេស្តភាពជាក់លាក់
ភាពជាក់លាក់នៃការពង្រីកហ្សែនគោលដៅត្រូវបានសាកល្បងដោយពិនិត្យមើលថាតើរូបភាព electrophoresis គឺជាក្រុមតែមួយ។ការផ្ទៀងផ្ទាត់តាមលំដាប់លំដោយ;ខ្សែកោងរលាយ ដើម្បីមើលថាតើផែនទីកំពូលគឺនៅលីវ។ការផ្ទៀងផ្ទាត់ការរំលាយអាហារអង់ស៊ីម និងវិធីសាស្រ្តផ្សេងទៀត។
នៅទីនេះយើងផ្តោតលើ tគាត់ធ្វើការវិភាគលើការពង្រីកមិនជាក់លាក់ដោយប្រើវិធីនៃការរលាយខ្សែកោង.និយាយជាទូទៅនៅពេលដែលយើងរចនា primers ទំហំនៃបំណែកផលិតផលគឺត្រូវបានទាមទារឱ្យស្ថិតនៅក្នុងជួរ 80-200bp ដែលធ្វើឱ្យសីតុណ្ហភាពរលាយនៃផលិតផល PCR ដល់ 80-85 ° C ។ដូច្នេះប្រសិនបើមានកំពូលផ្សេងៗ ត្រូវតែមានផលិតផល amplification មិនជាក់លាក់ផ្សេងទៀត;ប្រសិនបើកំពូលលេចឡើងនៅក្រោម 80 ° C, វាត្រូវបានចាត់ទុកថាជា primer dimer;ប្រសិនបើកំពូលលេចឡើងលើសពី 85 អង្សារសេ ជាទូទៅវាត្រូវបានចាត់ទុកថាជាការចម្លងរោគ DNA ឬការពង្រីកមិនជាក់លាក់នៃបំណែកធំៗ។
ចំណាំ៖ ពេលខ្លះមានកំពូលតែមួយនៅ 80°C។នៅពេលនេះគំនិតនេះត្រូវតែប្រកាន់ខ្ជាប់។វាទំនងជាថាលទ្ធផល amplification គឺ primer dimers ទាំងអស់។

ខ្សែកោងរលាយធម្មតា (កំពូលតែមួយ ដែលមិនមានការពង្រីកជាក់លាក់)

ខ្សែកោងរលាយដែលមានបញ្ហា (ការពង្រីកមិនជាក់លាក់នៃកំពូលភ្នំ)
【ការវិភាគករណី】

មានចំណុចកំពូលមួយ ប៉ុន្តែ primer dimer គឺធ្ងន់ធ្ងរ
ខ្សែកោងរលាយកំពូលតែមួយនៅក្នុងរូបភាពខាងក្រោមអាចបញ្ឆោតភ្នែករបស់អ្នកយ៉ាងងាយស្រួល ដោយគិតថាវាជាការពិសោធន៍ដ៏ល្អឥតខ្ចោះ ប៉ុន្តែលទ្ធផលគឺខុសទាំងស្រុង។នៅពេលនេះយើងត្រូវពិនិត្យមើលសីតុណ្ហភាពរលាយ។សីតុណ្ហភាពកំពូលគឺទាបជាង 80 ° C ដែលជា primer-dimer ទាំងស្រុង។

គ្មានបំណែកគោលដៅទេ សារធាតុ primer dimers ទាំងអស់។
នៅទីនេះ បងប្រុសរបស់ខ្ញុំមិនអាចឈប់បានទេ។រូបខាងក្រោមគឺជារូបថតដែលថតដោយទូរស័ព្ទដៃផ្ញើមកខ្ញុំដោយជនឆបោក។សារធាតុ​ដែល​គាត់​បាន​ប្រើ​គឺ​ជា​ម៉ាក​ដែល​គេ​ប្រើ​ជាទូទៅ​ក្នុង​ឧស្សាហកម្ម​នេះ។គាត់បានផ្លាស់ប្តូរពីម៉ាក T-prefix មួយទៅម៉ាក T-prefix ផ្សេងទៀត។ខ្ញុំគិតថាអ្នកបានទាយរួចហើយ។អ្នក​បោកប្រាស់​បាន​ស្រែក​ប្រាប់​ខ្ញុំ​ថា​៖ «​សារធាតុ​ដែល​ប្រើ​ក្នុង​រូប​ទី​មួយ​គឺ​ល្អ​ពេក ហើយ​កំពូល​គឺ​នៅ​លីវ។ក្រោយ​មក បន្ទាប់​ពី​ប្រើ​សារធាតុ​ប្រតិកម្ម​ដែល​អ្នក​បាន​ណែនាំ វា​ក្លាយ​ទៅ​ដូច​រូប​ទី​ពីរ ដោយ​មាន​កំពូល​ចម្រុះ។អ្នកបានធ្វើឱ្យខ្ញុំវេទនា។“
បំបែកក្រាហ្វទាំងពីរ។នៅ glance ដំបូង, មួយមានកំពូលតែមួយ, និងផ្សេងទៀតមានកំពូលពីរដង។មិនសមហេតុសមផល កំពូលតែមួយគឺពិតជាល្អណាស់។តើ​វា​ជា​ការ​ពិតមែន​ទេ?
អាក្រក់ជាង Dou E ទៀត បើខ្ញុំដាក់រូបទាំងពីរក្នុងរូបភាពខាងក្រោម អ្នកនឹងយល់ភ្លាមៗ។តាម​ពិត យើង​ងាយ​នឹង​ពិការ​ដោយសារ​រូបភាព​បែប​នេះ។បន្ទាប់ពីការវិភាគដោយប្រុងប្រយ័ត្ន យើងបានរកឃើញថា: កំពូលនៃតួលេខទីមួយគឺនៅ 75°C ដែលជា primer dimer ទាំងស្រុង។កំពូលនៃតួលេខទីពីរលេចឡើងនៅ 75 ° C និង 82 ° C យ៉ាងហោចណាស់មានផលិតផលលេចឡើង។

រូបថតរបស់ Feedback របស់សិស្ស
ដូច្នេះបញ្ហាជាមូលដ្ឋានមិនមែនជាបញ្ហានៃសារធាតុ reagents នោះទេ ប៉ុន្តែបញ្ហានៃការរចនា primer ។ទន្ទឹមនឹងនោះ វាក៏បង្ហាញឱ្យឃើញថា ម៉ាកយីហោធំៗមួយចំនួនមិនមានគុណភាពដែក ហើយវាក៏បង្ហាញឱ្យឃើញនូវអ្វីដែលបងប្រុសខ្ញុំបាននិយាយពីមុនផងដែរ៖ វាមិនមែនជាម៉ាក reagent ដែលគាំទ្រអត្ថបទរបស់អ្នកទេ។វាជាអត្ថបទរបស់អ្នកដែលបានផ្សព្វផ្សាយម៉ាកនៃសារធាតុប្រតិកម្ម។គ្រាន់តែស្រមៃថាប្រសិនបើ scumbag មិនបានផ្លាស់ប្តូរ reagents ទិន្នន័យខុសនឹងត្រូវបានបញ្ជូនទៅទិនានុប្បវត្តិហើយអ្វីដែលនឹងកើតឡើងនឹងក្លាយជាសោកនាដកម្មមួយ។
2. តម្លៃ Ct នៃការគ្រប់គ្រងទទេ
កុំពន្យល់ថាប្រសិនបើការគ្រប់គ្រងទទេមានតម្លៃ Ct វាមិនមែនជាការបំពុលទេ?ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយ អ្នកនៅតែត្រូវយល់ថា ការគ្រប់គ្រងទទេមួយណាមានតម្លៃ Ct ។ប្រសិនបើវាជា NTC វាមានន័យថាមាន DNA បរទេសដូចជាការចម្លងរោគ reagent ។ប្រសិនបើវាជា NRT វាមានន័យថា RNA ដែលស្រង់ចេញមានការចម្លងរោគ DNA ។
3. ខ្សែកោងស្តង់ដារ
រាប់បញ្ចូលទាំងជម្រាល និងរូបមន្តគណនា ប្រសិទ្ធភាព PCR អាចត្រូវបានគណនាតាមរូបមន្ត។ការពិសោធន៍ដ៏ល្អឥតខ្ចោះតម្រូវឱ្យចំណោទនៃខ្សែកោងស្តង់ដារដើម្បីចូលទៅជិត 3.32 និង R² ដើម្បីចូលទៅជិត 0.9999 ។
4. ជួរថាមវន្តលីនេអ៊ែរ
ជួរថាមវន្តនៃប្រតិកម្មគឺលីនេអ៊ែរ។យោងតាមគំរូដែលប្រើដើម្បីបង្កើតខ្សែកោងស្តង់ដារ ជួរថាមវន្តគួរតែរួមបញ្ចូលជម្រាលកំហាប់យ៉ាងហោចណាស់ 5 ហើយយកចិត្តទុកដាក់ចំពោះការផ្លាស់ប្តូរតម្លៃ Ct នៅជម្រាលកំហាប់ខ្ពស់ និងជម្រាលកំហាប់ទាប។
5. ភាពត្រឹមត្រូវនៃការរកឃើញ
ការផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុងលទ្ធផល qPCR នោះគឺ ភាពអាចធ្វើឡើងវិញបានមិនល្អ នោះគឺភាពជាក់លាក់មិនល្អគឺបណ្តាលមកពីកត្តាជាច្រើន រួមទាំងសីតុណ្ហភាព ការផ្តោតអារម្មណ៍ និងប្រតិបត្តិការ។ភាពជាក់លាក់របស់ qPCR ជាទូទៅអាចគ្រប់គ្រងបានតិចជាងមុន ដោយសារចំនួនចម្លងថយចុះ។បំរែបំរួលក្នុងពិសោធន៍តាមឧត្ដមគតិ បំរែបំរួលបច្ចេកទេសនេះគួរតែខុសពីបំរែបំរួលជីវសាស្រ្ត ហើយការចម្លងជីវសាស្រ្តអាចដោះស្រាយដោយផ្ទាល់នូវភាពខុសគ្នានៃស្ថិតិនៅក្នុងលទ្ធផល qPCR រវាងក្រុម ឬការព្យាបាល។ជាពិសេសសម្រាប់ការវិភាគរោគវិនិច្ឆ័យ ភាពជាក់លាក់អន្តរការវាយតម្លៃល្អបំផុត (អាចធ្វើម្តងទៀតបាន) នៅទូទាំងគេហទំព័រ និងប្រតិបត្តិករត្រូវតែត្រូវបានរាយការណ៍។
6. ប្រសិទ្ធភាពនៃការរកឃើញ និង LOD (ក្នុង multiplex qPCR)
LOD គឺជាកំហាប់ទាបបំផុតនៃ 95% នៃសំណាកវិជ្ជមានដែលបានរកឃើញ។និយាយម៉្យាងទៀតការប្រមូលផ្តុំ LOD ដែលមាននៅក្នុងសំណុំនៃការចម្លងហ្សែនគោលដៅមិនគួរលើសពី 5% នៃប្រតិកម្មដែលបរាជ័យនោះទេ។នៅពេលធ្វើការវិភាគ multiplex qPCR ជាពិសេសសម្រាប់ការរកឃើញក្នុងពេលដំណាលគ្នានៃការផ្លាស់ប្តូរចំណុច ឬពហុម៉ូហ្វិច multiplex qPCR ចាំបាច់ត្រូវផ្តល់ភស្តុតាងដែលថាភាពត្រឹមត្រូវនៃបំណែកគោលដៅជាច្រើនមិនត្រូវបានសម្របសម្រួលនៅក្នុងបំពង់តែមួយ ការរកឃើញច្រើន និងការរកឃើញបំពង់តែមួយ ប្រសិទ្ធភាព និង LOD គួរតែដូចគ្នា។ជាពិសេសនៅពេលដែលហ្សែនគោលដៅផ្តោតអារម្មណ៍ខ្ពស់ និងហ្សែនគោលដៅកំហាប់ទាបត្រូវបានពង្រីកក្នុងពេលដំណាលគ្នា បញ្ហានេះត្រូវតែយកចិត្តទុកដាក់។
បញ្ហា និងដំណោះស្រាយនិយាយជាទូទៅបញ្ហាដែលជួបប្រទះជាញឹកញាប់ក្នុងការបំបាត់កំហុស qPCR ផ្តោតលើទិដ្ឋភាពដូចខាងក្រោមៈ
·ការពង្រីកមិនជាក់លាក់
·ជម្រើសដ៏លំបាកនៃការប្រមូលផ្តុំ primer និងបញ្ហាជាមួយ primer-dimer
· សីតុណ្ហ​ភាព​មិន​ត្រឹមត្រូវ​
·រចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំប៉ះពាល់ដល់ប្រសិទ្ធភាពពង្រីក
ការពង្រីកមិនជាក់លាក់
ការពង្រីកមិនជាក់លាក់កើតឡើង ជាទូទៅវាត្រូវបានគេពិចារណាថាតើការរចនា primer មិនសមស្របទេ ប៉ុន្តែប្រសិនបើអ្នកមិនប្រញាប់ផ្លាស់ប្តូរ primers អ្នកអាចសាកល្បងវិធីខាងក្រោមជាមុនសិន (គោលការណ៍ត្រូវបានភ្ជាប់ផងដែរ):
· បង្កើនសីតុណ្ហភាព annealing - ព្យាយាមធ្វើឱ្យចំណងអ៊ីដ្រូសែនខ្សោយមិនអាចរក្សាបាន;
· កាត់បន្ថយរយៈពេល annealing និង elongation - កាត់បន្ថយឱកាសនៃចំណងអ៊ីដ្រូសែនខ្សោយ;
·កាត់បន្ថយកំហាប់ primer - កាត់បន្ថយឱកាសនៃការចងនៃ primers ដែលលែងត្រូវការតទៅទៀត និងតំបន់ដែលមិនមែនជាគោលដៅ។
ប្រសិទ្ធភាពពង្រីកទាប
ស្ថានភាពផ្ទុយទៅនឹង amplification មិនជាក់លាក់ - ប្រសិទ្ធភាព amplification ទាប ហើយវិធានការដើម្បីដោះស្រាយជាមួយ amplification ទាបគឺផ្ទុយពីនេះ៖
· ពន្យារ​ពេល​វេលា​នៃ​ការ​ស្រោប​និង​ការ​ពន្លូត​។
·ផ្លាស់ប្តូរទៅ PCR បីជំហាន និងកាត់បន្ថយសីតុណ្ហភាព annealing;
·បង្កើនកំហាប់ primer;
Ps៖ និស្សិតបញ្ចប់ការសិក្សាជាច្រើនដែលកើតក្នុងទសវត្សរ៍ទី 90 មិនចង់សិក្សាពីវិធីបំបាត់កំហុសសាកល្បងទេ ហើយសង្ឃឹមថាឧបករណ៍នេះអាចដោះស្រាយបញ្ហាបានទាំងស្រុង (ប្រសិនបើអ្នកចង់ទៅក្រុមហ៊ុន reagent ដើម្បីស្រាវជ្រាវ និងអភិវឌ្ឍបន្ទាប់ពីបញ្ចប់ការសិក្សា) តាមពិត ក្រុមហ៊ុនផលិត reagent ក៏គិតដូចនេះដែរ ខ្ញុំសង្ឃឹមថាវាជារឿងល្ងង់ខ្លៅដែលអាចប្រើបាននៅពេលដែលអ្នកទទួលបានវា ដូច្នេះអ្នកផលិត reagent ដើម្បីដោះស្រាយបញ្ហាដែលខ្សោយ រួមទាំងការប្រឹងប្រែងជាច្រើនរបស់ H. - កត្តាស្រូបទាញ។ដើម្បីងាយស្រួលដោះស្រាយបញ្ហា មនុស្សល្ងីល្ងើនៅតែត្រូវអានការណែនាំរបស់ក្រុមហ៊ុន reagent ដើម្បីមើលថាតើមានកត្តាដែលស្រូបយកចំណងអ៊ីដ្រូសែនខ្សោយឬអត់។
ជម្រើសដ៏លំបាកនៃការប្រមូលផ្តុំ primer និងបញ្ហាជាមួយ primer-dimer
វិធីសាស្រ្ត 1៖ និយាយជាទូទៅ ការណែនាំអំពីឧបករណ៍សម្រាប់ qPCR មានប្រព័ន្ធដែលបានណែនាំ និងការប្រមូលផ្តុំ primer ដែលបានណែនាំ។
វិធីសាស្រ្ត 2៖ បំបាត់កំហុសដោយកំណត់ជម្រាលនៃការផ្តោតអារម្មណ៍បឋម។រូបភាពខាងក្រោមត្រូវបានលួចពីក្រុមហ៊ុនមួយដើម្បីបង្ហាញ។រូបខាងក្រោមបង្ហាញពីលទ្ធផលបរិមាណ fluorescence ដែលបានធ្វើឡើងជាមួយនឹងជម្រាលកំហាប់បឋមចំនួនបី (100nM, 250nM, 500nM) និងជម្រាលកំហាប់គំរូចំនួនបួន (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng) ។តម្លៃ Ct នៃលទ្ធផលពិសោធន៍ត្រូវបានគ្រោងដូចខាងក្រោម៖

ការជ្រើសរើសកំហាប់បឋម បញ្ចូលកំហាប់ primer នីមួយៗទៅក្នុងបន្ទាត់ដូចខាងក្រោមៈ

ជម្រើសនៃការផ្តោតអារម្មណ៍បឋមគឺជាក់ស្តែងទំនាក់ទំនងលីនេអ៊ែរនៃកំហាប់បឋមនៃ 100nM និង 250nM គឺប្រសើរជាងហើយទំនាក់ទំនងលីនេអ៊ែរនៃកំហាប់បឋមនៃ 500nM គឺខ្សោយ។នៅក្នុង 100nM និង 250nM តម្លៃ Ct នៃ 250nM គឺតូចដែលទាក់ទងគ្នា ដូច្នេះកំហាប់ primer ល្អបំផុតគឺ 250nM ។ជាទូទៅ primer-dimers ធ្ងន់ធ្ងរអាចត្រូវបានគេមើលឃើញនៅក្នុងខ្សែកោងរលាយ។ចុះបើ primer ដែលបានរចនាមិនអាចជៀសវាង primer-dimer?
វិធីសាស្រ្ត 3៖ កាត់បន្ថយបរិមាណ primers និងបង្កើនសីតុណ្ហភាព annealing (មិនចាំបាច់ពន្យល់)។
តម្លៃជាក់ស្តែងនៃសីតុណ្ហភាព annealing គឺ 60 ° C ។ប្រសិនបើ​អ្នក​មិន​ប្រាកដ​ទេ តើ​ធ្វើ​ដូចម្តេច​ដើម្បី​ជ្រើសរើស​សីតុណ្ហភាព​ដែល​សមស្រប​ជាង​នេះ​?ចម្លើយគឺដូចគ្នានឹងជម្រើសនៃការផ្តោតអារម្មណ៍បឋម -ការធ្វើតេស្តជម្រាល.យករូបភាពពីក្រុមហ៊ុន Bio-rad ដើម្បីបង្ហាញពីបញ្ហា។សម្រាប់ការពង្រីកនៃបំណែកគោលដៅជាក់លាក់មួយ កំណត់ជម្រាលសីតុណ្ហភាពចំនួនប្រាំបី ដែលនីមួយៗមានពាក្យដដែលៗចំនួនបី ហើយខ្សែកោងនៃការពង្រីកដែលទទួលបានមានដូចខាងក្រោម៖

ការ​ជ្រើសរើស​សី​តុ​ណ្ហា​ភាព annealing​:
· 70°C, 69°C—ជាទូទៅ សារធាតុ primers មិនអាចបញ្ចូលគ្នាបានទេ ដូច្នេះមិនមានការពង្រីកទេ។
· 67.3°C – មាន​បរិមាណ​ពង្រីក​តិចតួច​នៅ​ដើម​ដំបូង ហើយ​តម្លៃ Ct គឺ​ធំ​គួរសម។
· 64.5°C — តម្លៃ Ct ថយចុះ។
· នៅសីតុណ្ហភាព 60.7°C, 58.0°C, 56.2°C និង 55.0°C តម្លៃ Ct ជាមូលដ្ឋានមានទំនោរទៅស្ថិរភាព ប៉ុន្តែតម្លៃ fluorescence ចុងក្រោយគឺខុសគ្នា។
តើធ្វើដូចម្តេចដើម្បីជ្រើសរើស?គោលការណ៍៖ គោលការណ៍ទីមួយគឺតម្លៃ Ct ខ្ពស់ជាង។សម្រាប់តម្លៃ Ct ដូចគ្នា សូមជ្រើសរើសសីតុណ្ហភាព annealing ខ្ពស់ជាង ដើម្បីជៀសវាងការបន្ថយ និង amplification មិនជាក់លាក់។ទោះបីជាមានតម្លៃ fluorescence ខ្ពស់ជាងនៅ 55 ° C ក៏ដោយ វាអាចមាន dimmer ឬ amplification មិនជាក់លាក់នៅក្នុងវា។
ប៉ុន្តែប្រសិនបើអ្នកឆ្លាតដូចអ្នក អ្នកប្រាកដជាគិតថា៖ និយាយតាមបែបឡូជីខល ប្រសិនបើប្រតិកម្ម PCR គឺជាក់លាក់ខ្លាំង ដរាបណាកំហាប់ primer លើសពីតម្រូវការអប្បបរមា ចំណុចខ្ពស់ និងទាបមិនគួរមានផលប៉ះពាល់ដូចថ្នាំ fluorescent និង dNTPs ទេ។ជាការពិតណាស់ ដរាបណាសីតុណ្ហភាព annealing ត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរត្រឹមត្រូវ ឥទ្ធិពលនៃកំហាប់ primer លើតម្លៃ Ct នឹងត្រូវបានបង្រួមអប្បបរមាដោយធម្មជាតិ។

សីតុណ្ហភាព annealing ត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរយ៉ាងត្រឹមត្រូវ ហើយឥទ្ធិពលនៃកំហាប់ primer លើ CT នឹងត្រូវបានបង្រួមអប្បបរមា
រចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំប៉ះពាល់ដល់ប្រសិទ្ធភាពពង្រីក
សូម​យក​រូបភាព​ពី Bio-rad ដើម្បី​បង្ហាញ​ពី​បញ្ហា។វាក៏រចនាជម្រាលសីតុណ្ហភាព ដើម្បីពង្រីកហ្សែនដែលមានរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំ។

រចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំលេចឡើង
វាអាចត្រូវបានគេមើលឃើញថានៅពេលដែលជម្រាលសីតុណ្ហភាពថយចុះ ផលិតផលចាប់ផ្តើមលេចឡើង ហើយតម្លៃ Ct ផ្លាស់ទីទៅមុខ ឈានដល់តម្លៃអប្បបរមានៅ 60.7 ° C ហើយបន្ទាប់មកនៅពេលដែលជម្រាលសីតុណ្ហភាពថយចុះ តម្លៃ Ct កាន់តែធំ។ផ្ទុយទៅវិញ នៅពេលដែលសីតុណ្ហភាពកើនឡើង រចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំនឹងបើក ហើយប្រសិទ្ធភាពនៃការពង្រីកកើនឡើង។បន្ទាប់ពីបានឈានដល់សីតុណ្ហភាពជាក់លាក់មួយ ការបង្កើនសីតុណ្ហភាពមិនអាចបង្កើនប្រសិទ្ធភាពនៃការពង្រីកបានទេ។ដោយសារតែ primers មិនអាចរួមបញ្ចូលគ្នាបានស្ថិរភាពនៅពេលនេះ។ដូច្នេះរកមើលសីតុណ្ហភាពជាមួយនឹងតម្លៃ Ct ទាបបំផុត។ដែលជាសីតុណ្ហភាពល្អបំផុតសម្រាប់ពង្រីកគំរូរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំ!ជាការពិតណាស់ មនុស្សល្ងីល្ងើត្រូវតែដឹងថា ប្រសិនបើវាមិនចាំបាច់ វាជាការល្អបំផុតក្នុងការផ្លាស់ប្តូរ primers និងជៀសវាងតំបន់រចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំ។
5. កម្រិតកម្មវិធី
MIQE - ការវិភាគទិន្នន័យ

ការវិភាគទិន្នន័យត្រូវបានផ្តល់ជាចម្បងដោយឧបករណ៍ PCR បរិមាណ fluorescent ។នៅក្នុងអត្ថបទមុន ការងារវិភាគទិន្នន័យជាច្រើនត្រូវបានធ្វើរួច ដូចជាការគ្រប់គ្រងទទេ ដែលត្រូវបានពន្យល់នៅក្នុងការរចនានៃការពិសោធន៍។ហ្សែនយោងខាងក្នុង លេខដដែលៗ។ល។ត្រូវបានបញ្ជាក់ឱ្យច្បាស់លាស់។នៅទីនេះយើងពន្យល់ជាចម្បងអំពីកម្មវិធី qPCR ។
qPCR ត្រូវ​បាន​គេ​ប្រើ​យ៉ាង​ទូលំទូលាយ ហើយ​ការ​ផ្ទៀងផ្ទាត់​ដោយ​ពិសោធន៍ និង​ការ​ធ្វើ​រោគវិនិច្ឆ័យ​អាស៊ីត​នុយក្លេ​អ៊ីក​គឺជា​សេណារីយ៉ូ​ដែល​គេ​ប្រើ​ញឹកញាប់​បំផុត។
បរិមាណដាច់ខាត
កំណត់ហេតុ (ការផ្តោតអារម្មណ៍ដំបូង) មានទំនាក់ទំនងលីនេអ៊ែរជាមួយនឹងចំនួនវដ្ត។ខ្សែកោងស្តង់ដារអាចត្រូវបានដកចេញពីស្តង់ដារដែលមានលេខច្បាប់ចម្លងដំបូងដែលគេស្គាល់ នោះគឺជាទំនាក់ទំនងលីនេអ៊ែរនៃប្រតិកម្ម amplification អាចទទួលបាន។យោងតាមតម្លៃ Ct នៃសំណាក កំហាប់នៅក្នុងសំណាកអាចត្រូវបានគណនា។ចំនួនគំរូដែលត្រូវបញ្ចូល។

វិធីសាស្រ្តគណនាបរិមាណដាច់ខាត
បរិមាណដាច់ខាតត្រូវតែផ្អែកលើខ្សែកោងស្តង់ដារ។ដើម្បីបង្កើតខ្សែកោងស្តង់ដារមួយត្រូវបានទាមទារ។ជាធម្មតា ស្តង់ដារគឺជា plasmid ដែលទទួលបានដោយការក្លូនហ្សែនគោលដៅ។ហេតុអ្វីបានជាវាជាប្លាស្មា?ដោយសារតែ DNA plasmid រាងជារង្វង់មានស្ថេរភាពបំផុត។ពនលាយផលិតផលស្ដង់ដារក្នុងកម្រិត 5 ទៅ 6 តាមសមាមាត្រទ្វេរដង (ការពនលាយ 10 ដង) ហើយយកចិត្តទុកដាក់លើភាពស្មើគ្នានៅពេលពនលាយ។អនុញ្ញាតឱ្យតម្លៃ Ct ធ្លាក់ចុះនៅចន្លោះ 15-30 ។

ការរៀបចំស្តង់ដារ
ក្នុងពេលជាមួយគ្នានេះ គំរូដែលត្រូវធ្វើតេស្តក៏គួរត្រូវបានពនរទៅតាមនោះដែរ (ចងចាំកត្តារំលាយ) ហើយតម្លៃ Ct ក៏គួរតែធ្លាក់ចុះពី 15-30 ផងដែរ។ផលិតផលស្ដង់ដារ + គំរូដែលត្រូវធ្វើតេស្តត្រូវបានដាក់នៅលើម៉ាស៊ីនជាមួយគ្នា។បន្ទាប់ពីការរត់ ខ្សែកោងស្តង់ដារមួយត្រូវបានធ្វើឡើងជាមួយនឹងសារធាតុស្តង់ដារ ហើយសំណាកដែលត្រូវធ្វើតេស្តត្រូវបាននាំយកទៅក្នុងខ្សែកោងស្តង់ដារដើម្បីគណនាកំហាប់។
បរិមាណវីរុសរលាកថ្លើមប្រភេទ B HBV គឺជាបរិមាណដាច់ខាតធម្មតា ដែលអាចគណនាលេខចម្លងមេរោគក្នុងឈាម 1ml ។
ការគណនាលេខចម្លង
កំហាប់គំរូដែលត្រូវធ្វើតេស្ត (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × កត្តារលាយ
ទំងន់ម៉ូលេគុលគំរូ = ចំនួនមូលដ្ឋាន × 324
លេខចម្លងនៃគំរូដែលត្រូវធ្វើតេស្ត (ច្បាប់ចម្លង/ul) = កំហាប់នៃគំរូដែលត្រូវធ្វើតេស្ត / ទម្ងន់ម៉ូលេគុលនៃគំរូ × 6 × 1014

វិធីសាស្រ្តគណនាលេខចម្លង

ខាងលើគឺជាវិធីសាស្ត្រគណនាសម្រាប់កំណត់បរិមាណ។នេះគឺជាបញ្ហាគណិតវិទ្យាដែលអាចដោះស្រាយបានបន្ទាប់ពីបញ្ចប់ការសិក្សានៅអនុវិទ្យាល័យ ហើយបញ្ហាគណិតវិទ្យាជាទូទៅត្រូវបានដោះស្រាយដោយកុំព្យូទ័រ។បើមិនយល់អាចមកទំនាក់ទំនងបាន។
បរិមាណដែលទាក់ទង
បរិមាណដែលទាក់ទងត្រូវបានប្រើជាចម្បងក្នុងការស្រាវជ្រាវវិទ្យាសាស្ត្រ។តើមានមេរោគប៉ុន្មាននៅក្នុងឈាម 1ml ហើយវាគឺជាមេរោគ DNA នេះគឺជាព្រឹត្តិការណ៍កំណត់ដែលទាក់ទងគ្នា៖ បរិមាណឈាមអាចកំណត់បាន ហើយមេរោគ DNA មានស្ថេរភាព។ទោះបីជាយ៉ាងណាក៏ដោយ វាជាការលំបាកសម្រាប់យើងក្នុងការប្រៀបធៀបចំនួនចម្លងចម្លងនៃហ្សែនជាក់លាក់មួយនៅក្នុងស្លឹក ព្រោះវាពិបាកក្នុងការកំណត់ទំហំ ទម្ងន់ និងភាពទន់ភ្លន់នៃស្លឹក បរិមាណនៃ RNA ដែលស្រង់ចេញពិបាកកំណត់ ហើយប្រសិទ្ធភាពនៃការចម្លងបញ្ច្រាសក៏ពិបាកក្នុងការកំណត់ដែរ មានន័យថា ជំហានណាមួយអាចធ្វើឱ្យទិន្នន័យពិសោធន៍មានកំហុស និងមិនអាចប្រើប្រាស់បាន។
ដូច្នេះ បរិមាណដែលទាក់ទងត្រូវតែណែនាំធាតុមួយ៖ហ្សែនយោងខាងក្នុង។
ម្យ៉ាងវិញទៀត បរិមាណដែលទាក់ទងគឺពិតជាការប្រៀបធៀបរវាងហ្សែនគោលដៅ និងហ្សែនយោងខាងក្នុង។បើប្រៀបធៀបនៅក្នុងជាលិកាដូចគ្នា និងកោសិកាដូចគ្នា ឥទ្ធិពលនៃទំហំគំរូ បរិមាណនៃការទាញយក RNA ប្រសិទ្ធភាពនៃការចម្លងបញ្ច្រាស និងប្រសិទ្ធភាព PCR គឺតូច។ដោយសារតែទំហំគំរូតូច ទាំងហ្សែនយោងខាងក្នុង និងហ្សែនគោលដៅត្រូវបានកាត់បន្ថយ។នេះ​ជា​មូលហេតុ​ដែល​យើង​បាន​សង្កត់ធ្ងន់​លើ​ឯកសណ្ឋាន និង​ស្ថិរភាព​ពីមុនមក។
ហ្សែនយោងខាងក្នុងជាទូទៅហ្សែនថែរក្សាផ្ទះ( house-keeping genes) ដែលសំដៅទៅលើប្រភេទហ្សែនដែលបង្ហាញដោយស្ថេរភាពនៅក្នុងកោសិកាទាំងអស់ ហើយផលិតផលរបស់ពួកគេគឺចាំបាច់ដើម្បីរក្សាសកម្មភាពជីវិតជាមូលដ្ឋានរបស់កោសិកា។
កុំច្រឡំគំនិតនេះ។ហ្សែនថែរក្សាផ្ទះគឺជាលក្ខខណ្ឌមុខងារជីវសាស្រ្ត ចំណែកឯហ្សែនយោងខាងក្នុងគឺជាពាក្យបច្ចេកទេសពិសោធន៍។ហ្សែនថែរក្សាគេហដ្ឋានត្រូវឆ្លងកាត់ការផ្ទៀងផ្ទាត់ មុនពេលពួកវាអាចត្រូវបានជ្រើសរើសជាហ្សែនយោងខាងក្នុង។
ជាឧទាហរណ៍ យើងបានជ្រើសរើសហ្សែនថែរក្សាគេហដ្ឋានជាច្រើននៅក្នុងរូបភាពខាងក្រោម ដើម្បីសាកល្បងកម្រិតបញ្ចេញមតិរបស់ពួកគេនៅក្នុងកោសិកាជាលិកាផ្សេងៗគ្នា ហើយបានរកឃើញថាកម្រិតបញ្ចេញមតិរបស់ β-2-microglobulin គឺខុសគ្នាខ្លាំងពីហ្សែនទាំងបីផ្សេងទៀត ដូច្នេះពួកវាមិនអាចប្រើជាហ្សែនយោងខាងក្នុងបានទេ។

បន្ទាប់ពីយល់ពីមុខងារកែតម្រូវនៃហ្សែនយោងខាងក្នុង ក្បួនដោះស្រាយពីរត្រូវបានចេញមកពីការណែនាំនៃហ្សែនយោងខាងក្នុង។
·វិធីសាស្ត្រខ្សែកោងស្តង់ដារទ្វេ
· 2 – △△ វិធីសាស្ត្រ Ct (វិធីសាស្ត្រប្រៀបធៀបតម្លៃ CT)
ប្រសិនបើអ្នកចាប់អារម្មណ៍ក្នុងការសិក្សាប្រភេទសត្វ និងមុខងារហ្សែន សូមបោះបង់ការស្រាវជ្រាវលើក្បួនដោះស្រាយ និងប្រើរូបមន្តដោយផ្ទាល់ ឬប្រើម៉ាស៊ីនដោយផ្ទាល់។ប្រសិនបើអ្នកជាបុរសត្រង់ផ្នែកគណិតវិទ្យា និងវិស្វកម្ម សូមមានអារម្មណ៍សេរី។
វិធីសាស្ត្រខ្សែកោងស្តង់ដារទ្វេ
កំណត់បរិមាណហ្សែនគោលដៅ និងហ្សែនថែរក្សាផ្ទះនៃគំរូវត្ថុបញ្ជា និងគំរូដែលត្រូវធ្វើតេស្តតាមរយៈខ្សែកោងស្តង់ដារ ហើយបន្ទាប់មកគណនាតម្លៃដែលទាក់ទងដោយយោងតាមរូបមន្តគណនា ដែលជាកម្រិតកន្សោមទាក់ទង។
គុណសម្បត្តិ៖ ការវិភាគសាមញ្ញ ការបង្កើនប្រសិទ្ធភាពពិសោធន៍សាមញ្ញ
គុណវិបត្តិ៖ សម្រាប់ហ្សែននីមួយៗ ការពិសោធន៍នីមួយៗត្រូវតែបង្កើតខ្សែកោងស្តង់ដារ
កម្មវិធី៖ វិធីសាស្រ្តមួយក្នុងចំណោមវិធីសាស្រ្តបរិមាណដែលទាក់ទងគ្នាច្រើនបំផុតពីរដែលត្រូវបានប្រើប្រាស់ និងទទួលស្គាល់ក្នុងការសិក្សាអំពីបទប្បញ្ញត្តិនៃការបញ្ចេញហ្សែន
រូបមន្តមានដូចខាងក្រោម៖

ឧទាហរណ៍មានដូចខាងក្រោម៖

គណនាចំនួនដែលទាក់ទងដោយផ្អែកលើលទ្ធផលបរិមាណ
2 – វិធីសាស្រ្ត △△ Ct (វិធីសាស្ត្រប្រៀបធៀបតម្លៃ CT)

គុណសម្បត្តិ៖ មិនចាំបាច់ធ្វើខ្សែកោងស្តង់ដារទេ។
គុណវិបត្តិ: វាត្រូវបានសន្មត់ថាប្រសិទ្ធភាព amplification គឺជិត 100%;គម្លាតស្តង់ដារគឺ < 5% ហើយខ្សែកោងស្តង់ដារ និងប្រសិទ្ធភាពរវាងការពង្រីកនីមួយៗត្រូវបានសន្មត់ថាស្របគ្នា;ការបង្កើនប្រសិទ្ធភាពនៃលក្ខខណ្ឌពិសោធន៍គឺកាន់តែស្មុគស្មាញ។
កម្មវិធី៖ វិធីសាស្រ្តមួយក្នុងចំណោមវិធីសាស្រ្តបរិមាណដែលទាក់ទងគ្នាច្រើនបំផុតពីរដែលត្រូវបានប្រើប្រាស់ និងទទួលស្គាល់ក្នុងការសិក្សាអំពីបទប្បញ្ញត្តិនៃការបញ្ចេញហ្សែន

ជាការពិតណាស់ ប្រសិទ្ធភាព amplification ជាធម្មតាមិនអាចទៅរួចនោះទេ 1. វិធីសាស្ត្រកែតម្រូវ៖ ប្រសិនបើយើងដឹងថាហ្សែនគោលដៅ និងហ្សែនយោងមានប្រសិទ្ធភាព amplification ដូចគ្នា ប៉ុន្តែប្រសិទ្ធភាព amplification គឺមិនស្មើនឹង 1 នោះ 2－△△Ct អាចត្រូវបានកែដំរូវដូចជា: (1+E)－△△ Ct នោះ រូបមន្តគឺ 0 ត្រឹមត្រូវ ឧទាហរណ៏ 0. ទៅ 1.95－△△ Ct
រហូតមកដល់ពេលនេះ ខ្លឹមសារអំពី PCR បរិមាណ fluorescent បានមកដល់ទីបញ្ចប់ហើយ។