កញ្ចប់ Cell Direct RT qPCR—SYBR GREEN I Direct Cell Lysis Cell រួចរាល់ កញ្ចប់មួយជំហានម្តង qRT-PCR
ការពិពណ៌នា
ឧបករណ៍នេះប្រើប្រព័ន្ធសតិបណ្ដោះអាសន្ន lysis តែមួយគត់ដែលអាចបញ្ចេញ RNA យ៉ាងឆាប់រហ័សពីគំរូកោសិកាវប្បធម៌សម្រាប់ប្រតិកម្ម RT-qPCR ដោយហេតុនេះការលុបបំបាត់ដំណើរការបន្សុត RNA ដែលចំណាយពេលវេលា និងកម្លាំងពលកម្ម។គំរូ RNA អាចទទួលបានក្នុងរយៈពេលត្រឹមតែ 7 នាទីប៉ុណ្ណោះ។៥×Direct RT Mix និង ២×ដោយផ្ទាល់ qPCR Mix-SYBR reagents ដែលផ្តល់ដោយឧបករណ៍អាចទទួលបានលទ្ធផល PCR បរិមាណតាមពេលវេលាជាក់ស្តែង និងយ៉ាងឆាប់រហ័ស។
5×Direct RT Mix និង ២×ដោយផ្ទាល់ qPCR Mix-SYBR មានភាពអត់ធ្មត់ខ្លាំង ហើយ lysate នៃគំរូអាចត្រូវបានប្រើជាគំរូសម្រាប់ RT-qPCR ដោយផ្ទាល់។ឧបករណ៍នេះមានផ្ទុកនូវ RNA reverse transcriptase ដែលមានទំនាក់ទំនងខ្ពស់តែមួយគត់របស់ Foregene និង Hot D-Taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl2សតិបណ្ដោះអាសន្នប្រតិកម្ម ឧបករណ៍បង្កើនប្រសិទ្ធភាព PCR និងស្ថេរភាព។
លក្ខណៈបច្ចេកទេស
២០០×20μលីត្រ Rxns, 1000×20μលីត្រ Rxns
សមាសធាតុនៃកញ្ចប់
| ផ្នែក I | Buffer CL |
| Foregene Protease Plus II | |
| Buffer ST | |
| ផ្នែកទី II | ជ័រលុប DNA |
| 5 × ល្បាយ RT ផ្ទាល់ | |
| 2 × ផ្ទាល់ qPCR Mix-SYBR | |
| 50 × ROX Reference Dye | |
| RNase-Free ddH2O | |
| សេចក្តីណែនាំ | |
លក្ខណៈពិសេស & គុណសម្បត្តិ
■សាមញ្ញ និងមានប្រសិទ្ធភាព៖ ជាមួយនឹងបច្ចេកវិទ្យា Cell Direct RT គំរូ RNA អាចទទួលបានក្នុងរយៈពេលត្រឹមតែ 7 នាទីប៉ុណ្ណោះ។
■ តំរូវការគំរូគឺតូច ដែលអាចសាកល្បងបាន 10 កោសិកា។
■ ការបញ្ជូនថាមពលខ្ពស់៖ វាអាចរកឃើញ RNA យ៉ាងឆាប់រហ័សនៅក្នុងកោសិកាដែលត្រូវបានដាំដុះក្នុង 384, 96, 24, 12, 6-well plates ។
■ DNA Eraser អាចលុបហ្សែនដែលបានចេញផ្សាយយ៉ាងឆាប់រហ័ស កាត់បន្ថយផលប៉ះពាល់យ៉ាងខ្លាំងទៅលើលទ្ធផលពិសោធន៍ជាបន្តបន្ទាប់។
■ ប្រព័ន្ធ RT និង qPCR ដែលត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងធ្វើឱ្យការចម្លងបញ្ច្រាស RT-PCR ពីរជំហានកាន់តែមានប្រសិទ្ធភាព និង PCR កាន់តែជាក់លាក់ និងធន់នឹងថ្នាំទប់ស្កាត់ប្រតិកម្ម RT-qPCR ។
កម្មវិធីកញ្ចប់
វិសាលភាពនៃការអនុវត្ត៖ កោសិកាដាំដុះ។
- RNA បញ្ចេញដោយ លីហ្សីសគំរូ៖ អាចអនុវត្តបានតែចំពោះគំរូ RT-qPCR នៃឧបករណ៍នេះប៉ុណ្ណោះ។
- ឧបករណ៍នេះអាចត្រូវបានប្រើសម្រាប់គោលបំណងដូចខាងក្រោមៈ ការវិភាគការបញ្ចេញហ្សែន ការផ្ទៀងផ្ទាត់ប្រសិទ្ធភាពនៃការបំបិទហ្សែនដែលសម្របសម្រួលដោយ siRNA ការពិនិត្យថ្នាំ។ល។
ដ្យាក្រាម
ការផ្ទុកនិងអាយុកាលធ្នើ
ផ្នែក I នៃកញ្ចប់នេះគួរតែត្រូវបានរក្សាទុកនៅ 4 ℃;ផ្នែកទី II គួរតែត្រូវបានរក្សាទុកនៅ -20 ℃។
Foregene Protease Plus II គួរតែត្រូវបានរក្សាទុកនៅ 4℃, មិនបង្កកនៅ -20 ℃។
សារធាតុ Reagent ២×qPCR Mix-SYBR ដោយផ្ទាល់គួរតែត្រូវបានរក្សាទុកនៅ -20℃នៅក្នុងទីងងឹត;ប្រសិនបើប្រើញឹកញាប់ វាក៏អាចរក្សាទុកនៅលេខ 4 ផងដែរ។℃សម្រាប់ការផ្ទុករយៈពេលខ្លី (ប្រើឡើងក្នុងរយៈពេល 10 ថ្ងៃ) ។
គោលការណ៍នៃការរចនាបឋម PCR ពេលវេលាពិត
Primer ទៅមុខ និង បញ្ច្រាស primer
សម្រាប់ PCR ពេលវេលាពិត ការរចនាបឋមមានសារៈសំខាន់ណាស់។Primers ត្រូវបានទាក់ទងទៅនឹងភាពជាក់លាក់ និងប្រសិទ្ធភាពនៃការពង្រីក PCR ហើយអាចត្រូវបានរចនាដោយយោងទៅលើគោលការណ៍ដូចខាងក្រោមៈ
ប្រវែង primer: 18-30bp ។
មាតិកា GC: 40-60% ។
តម្លៃ Tm៖ កម្មវិធីរចនាបឋម ដូចជា Primer 5 អាចផ្តល់តម្លៃ Tm នៃ primer ។តម្លៃ Tm នៃ primers ខាងលើ និងខាងក្រោមគួរតែនៅជិតបំផុតតាមដែលអាចធ្វើទៅបាន។រូបមន្តគណនា Tm ក៏អាចប្រើបានដែរ៖ Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T) ។នៅពេលអនុវត្ត PCR សីតុណ្ហភាពក្រោមតម្លៃ primer Tm នៃ 5 ° C ជាទូទៅត្រូវបានជ្រើសរើសជាសីតុណ្ហភាព annealing (ការកើនឡើងដែលត្រូវគ្នានៃសីតុណ្ហភាព annealing អាចបង្កើនភាពជាក់លាក់នៃប្រតិកម្ម PCR) ។
ថ្នាំ primers និង PCR ផលិតផល៖
ប្រវែងផលិតផលពង្រីក PCR primer គឺល្អជាង 100-150bp ។
ការរចនា primers នៅក្នុងតំបន់រចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំនៃគំរូគួរតែត្រូវបានជៀសវាងឱ្យបានច្រើនតាមដែលអាចធ្វើទៅបាន។
ជៀសវាងការបង្កើតមូលដ្ឋានបំពេញបន្ថែម 2 ឬច្រើនរវាងចុង 3′ នៃ primers ខាងលើ និងខាងក្រោម។
មូលដ្ឋានស្ថានីយ Primer 3′ មិនអាចមានវត្តមានជាមួយ G ឬ C ជាប់គ្នា 3 បន្ថែមទេ។
ថ្នាំ primers ខ្លួនឯងមិនអាចមានរចនាសម្ព័ន្ធបំពេញបន្ថែមទេបើមិនដូច្នេះទេរចនាសម្ព័ន្ធសក់នឹងត្រូវបានបង្កើតឡើងដែលប៉ះពាល់ដល់ការពង្រីក PCR ។
ATCG គួរតែត្រូវបានចែកចាយស្មើៗគ្នាតាមដែលអាចធ្វើទៅបាននៅក្នុងលំដាប់បឋម ហើយមូលដ្ឋានស្ថានីយ 3′ គួរតែត្រូវបានជៀសវាងដូចជា T.
ឧបសម្ព័ន្ធទី 1៖ កញ្ចប់បន្ថែមសមាសភាគ Cell Direct RT-qPCR
1.ដំណោះស្រាយកោសិកាលីស
|
| |||
| សមាសធាតុនៃកញ្ចប់ (ប្រព័ន្ធលីលីស ២៤-អណ្តូង) | DRT-01011-A1 | DRT-01011-A2 | |
| 100 ធ | 500 ធ | ||
| ផ្នែកI | Buffer CL | 20 មីលីលីត្រ | 100 មីលីលីត្រ |
| Foregene Protease Plus II | 400 μl | 1 មីលីលីត្រ × 2 | |
| Buffer ST | 1 មីលីលីត្រ × 2 | 10 មីលីលីត្រ | |
| ផ្នែកII | ជ័រលុប DNA | 400 μl | 1 មីលីលីត្រ × 2 |
2.RT លាយ
|
| |
| សមាសធាតុនៃកញ្ចប់ (ប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម 20 μl) | DRT-01011-B1 |
| ២០០ ធ | |
| 5 × ល្បាយ RT ផ្ទាល់ | 800 μl |
| RNase-Free ddH2O | 1.7ml × 2 |
|
| ||
| សមាសធាតុនៃកញ្ចប់ (ប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម 20 μl) | DRT-01011-C1 | DRT-01011-C2 |
| ២០០ ធ | 1000 ធ | |
| 2 × ផ្ទាល់ qPCR Mix-SYBR | 1 មីលីលីត្រ × 2 | 1.7ml × 6 |
| 50 × ROX Reference Dye | 40 μl | 200 μl |
| RNase-Free ddH2O | 1.7 មីលីលីត្រ | 10 មីលីលីត្រ |
សៀវភៅណែនាំ៖
