ការក្រៀវនៃគន្លឹះ pipette និងបំពង់ EP ។ល។

1. រៀបចំ 0.1% (មួយពាន់) DEPC (សារធាតុពុលខ្ពស់) ជាមួយនឹងទឹក deionized, ប្រើវាដោយប្រុងប្រយ័ត្ននៅក្នុង hood fume និងរក្សាទុកវានៅ 4 ° C ឆ្ងាយពីពន្លឺ;

ទឹក DEPC គឺជាទឹកសុទ្ធដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ DEPC និងក្រៀវដោយសីតុណ្ហភាពខ្ពស់ និងសម្ពាធខ្ពស់។ធ្វើតេស្តដើម្បីគ្មាន RNase, DNase និងប្រូតេអ៊ីន។

2. ដាក់ចុង pipette និងបំពង់ EP ចូលទៅក្នុង 0.1% DEPC ហើយធានាថាចុង pipette និង EP tube ត្រូវបានបំពេញដោយ 0.1% DEP ។

3. ការពារពីពន្លឺ ទុកឱ្យឈរមួយយប់ (12-24 ម៉ោង)

4. ប្រអប់ដែលមានព័ត៌មានជំនួយ និងបំពង់ EP មិនចាំបាច់ត្រូវត្រាំក្នុង DEPC ទេ។បនា្ទាប់ពីដកទឹក DEPC ចេញក្នុងចុងឬបំពង់ EP រួចខ្ចប់វាហើយរុំវា។

5. 121 អង្សាសេ, 30 នាទី។

6. 180 អង្សាសេ ស្ងួតរយៈពេលជាច្រើនម៉ោង (យ៉ាងហោចណាស់ 3 ម៉ោង)

ចំណាំ៖ ក.ពាក់ស្រោមដៃជ័រ និងម៉ាសពេលដោះស្រាយ DEPC!b ឬដោយគ្មានការក្រៀវ DEPC 130 ℃ autoclave 90 នាទី (មន្ទីរពិសោធន៍ជាច្រើន ការក្រៀវសីតុណ្ហភាពខ្ពស់ពីរដង)

ការពិចារណាលើការទាញយក RNA

បាតុភូតសំខាន់ពីរនៃការបរាជ័យឯកោ RNA ជាលិកា

ការរិចរិល RNA និងសំណល់នៃសារធាតុមិនបរិសុទ្ធនៅក្នុងជាលិកា,ទាក់ទងនឹងការរិចរិល សូមក្រឡេកមើលជាដំបូងថាហេតុអ្វីបានជា RNA ចម្រាញ់ចេញពីកោសិកាវប្បធម៌មិនងាយបំផ្លាញ។សារធាតុចម្រាញ់ចេញពី RNA ដែលមានស្រាប់ទាំងអស់មានសមាសធាតុដែលរារាំង RNase យ៉ាងឆាប់រហ័ស។បន្ថែម lysate ទៅកោសិកាវប្បធម៌ ហើយគ្រាន់តែលាយវា កោសិកាទាំងអស់អាចត្រូវបានលាយបញ្ចូលគ្នាយ៉ាងហ្មត់ចត់ជាមួយ lysate ហើយកោសិកាត្រូវបាន lysed ទាំងស្រុង។បន្ទាប់ពីកោសិកាត្រូវបាន lysed សារធាតុសកម្មនៅក្នុង lysate ភ្លាមរារាំង RNase ខាងក្នុងកោសិកា ដូច្នេះ RNA នៅដដែល។នោះគឺដោយសារតែកោសិកាវប្បធម៌ត្រូវបានទាក់ទងយ៉ាងងាយស្រួលនិងពេញលេញជាមួយ lysate នោះ RNA របស់ពួកគេមិនងាយខូចទ្រង់ទ្រាយទេ។ម៉្យាងវិញទៀត RNA នៅក្នុងជាលិកាងាយខូចដោយសារកោសិកាក្នុងជាលិកាមិនងាយទាក់ទងទៅ lysate យ៉ាងឆាប់រហ័ស។ដោយសារតែទំនាក់ទំនងគ្រប់គ្រាន់។ដូច្នេះដោយសន្មតថាមានវិធីមួយដើម្បីបង្វែរជាលិកាទៅជាកោសិកាតែមួយខណៈពេលដែលរារាំងសកម្មភាព RNA បញ្ហានៃការរិចរិលអាចត្រូវបានដោះស្រាយទាំងស្រុង។

ការកិនអាសូតរាវគឺជាវិធីសាស្ត្រដ៏មានប្រសិទ្ធភាពបំផុត។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ វិធីសាស្ត្រកិនអាសូតរាវគឺមានបញ្ហាខ្លាំងណាស់ ជាពិសេសនៅពេលដែលចំនួនសំណាកមានច្រើន។នេះនាំឱ្យមានអ្វីដែលល្អបំផុតបន្ទាប់: ឧបករណ៍លាយ។នេះ។ឧបករណ៍លាយវិធីសាស្រ្តមិនគិតពីសំណួរអំពីរបៀបដែលសកម្មភាព RNase ត្រូវបានរារាំងមុនពេលកោសិកាត្រូវបានទាក់ទងជាមួយ lysate នោះទេប៉ុន្តែជាការអធិស្ឋានថាអត្រានៃការរំខានជាលិកាគឺលឿនជាងអត្រាដែល RNase intracellular degrades RN ។

ប្រសិទ្ធភាពនៃអេឡិចត្រិច homogenizer គឺប្រសើរជាង,ហើយឥទ្ធិពលនៃកញ្ចក់ homogenizer គឺខ្សោយ ប៉ុន្តែជាទូទៅ វិធីសាស្ត្រ homogenizer មិនអាចការពារបាតុភូត degradation បានទេ។ដូច្នេះប្រសិនបើការស្រង់ចេញត្រូវបានរិចរិល នោះម៉ាស៊ីនអេឡិចត្រិចដើមគួរតែត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការកិនជាមួយអាសូតរាវ។ឧបករណ៍លាយកញ្ចក់ដើមគួរតែត្រូវបានផ្លាស់ប្តូរទៅជា homogenizer អគ្គិសនី ឬកិនដោយផ្ទាល់ជាមួយអាសូតរាវ។បញ្ហាគឺស្ទើរតែ 100% អាចធ្វើទៅបាន។ដោះស្រាយ។

បញ្ហាសំណល់មិនបរិសុទ្ធដែលប៉ះពាល់ដល់ការពិសោធន៍ជាបន្តបន្ទាប់មានមូលហេតុចម្រុះជាងការរិចរិល ហើយដំណោះស្រាយគឺខុសគ្នា។សរុបសេចក្តីមកប្រសិនបើមានការរិចរិល ឬភាពមិនបរិសុទ្ធដែលនៅសេសសល់នៅក្នុងជាលិកានោះ វិធីសាស្ត្រស្រង់ចេញ/សារធាតុប្រតិកម្មសម្រាប់សម្ភារៈពិសោធន៍ជាក់លាក់ត្រូវតែធ្វើឱ្យប្រសើរ។អ្នកមិនចាំបាច់ប្រើសំណាកដ៏មានតម្លៃរបស់អ្នកសម្រាប់ការបង្កើនប្រសិទ្ធភាពទេ៖ អ្នកអាចទិញសត្វតូចៗមួយចំនួនដូចជាត្រី/មាន់ពីទីផ្សារ យកផ្នែកដែលត្រូវគ្នានៃសម្ភារៈសម្រាប់ការទាញយក RNA និងផ្នែកផ្សេងទៀតសម្រាប់ការទាញយកប្រូតេអ៊ីន - កិនជាមួយមាត់ ក្រពះ និងពោះវៀន។

RNA គោលដៅនៃ RNA ដែលបានស្រង់ចេញត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការពិសោធន៍តាមដានផ្សេងៗគ្នា ហើយតម្រូវការគុណភាពរបស់វាគឺខុសគ្នា

ការសាងសង់បណ្ណាល័យ cDNA ទាមទារភាពសុចរិតរបស់ RNA ដោយគ្មានសំណល់នៃសារធាតុរារាំងប្រតិកម្មអង់ស៊ីម។ភាគខាងជើងទាមទារភាពសុចរិត RNA ខ្ពស់ និងតម្រូវការទាបសម្រាប់សំណល់អង់ស៊ីម inhibitors ប្រតិកម្ម;RT-PCR មិនតម្រូវឱ្យមានភាពសុចរិត RNA ខ្ពស់ពេកទេប៉ុន្តែរារាំងប្រតិកម្មអង់ស៊ីម។តម្រូវការសំណល់គឺតឹងរ៉ឹង។ការបញ្ចូលកំណត់ទិន្នផល;រាល់ពេលដែលគោលដៅគឺដើម្បីទទួលបាន RNA ដ៏បរិសុទ្ធខ្ពស់បំផុត វានឹងធ្វើឱ្យមនុស្ស និងប្រាក់ខាតបង់។

ការប្រមូល / ការផ្ទុកគំរូ

កត្តាដែលប៉ះពាល់ដល់ការរិចរិល បន្ទាប់ពីសំណាកសំណាកចាកចេញពីរាងកាយរស់នៅ/ឬបរិយាកាសលូតលាស់ដើម អង់ស៊ីម endogenous នៅក្នុងគំរូនឹងចាប់ផ្តើម degrade RNA,ហើយអត្រា degradation គឺទាក់ទងទៅនឹងមាតិកានៃអង់ស៊ីម endogenous និងសីតុណ្ហភាព។ជាប្រពៃណី មានតែវិធីពីរយ៉ាងក្នុងការទប់ស្កាត់សកម្មភាពអង់ស៊ីម endogenous ទាំងស្រុង: បន្ថែម lysate ភ្លាមៗ និង homogenize យ៉ាងហ្មត់ចត់ និងឆាប់រហ័ស។កាត់ជាបំណែកតូចៗ ហើយបង្កកភ្លាមៗក្នុងអាសូតរាវ។វិធីសាស្រ្តទាំងពីរតម្រូវឱ្យមានប្រតិបត្តិការលឿន។ក្រោយមកទៀតគឺសមរម្យសម្រាប់គំរូទាំងអស់ ខណៈពេលដែលអតីតគឺសមរម្យសម្រាប់តែជាលិកាដែលមានមាតិកាទាបនៃកោសិកា និងអង់ស៊ីម endogenous និងងាយស្រួលក្នុងការធ្វើដូចគ្នានេះ។ជាពិសេស ជាលិការុក្ខជាតិ ថ្លើម ទីមុស លំពែង លំពែង ខួរក្បាល ខ្លាញ់ ជាលិកាសាច់ដុំ ជាដើម ត្រូវបានកកល្អបំផុតជាមួយនឹងអាសូតរាវ មុនពេលដំណើរការ។

ការបំបែក និងការធ្វើឱ្យដូចគ្នានៃគំរូ

កត្តាដែលប៉ះពាល់ដល់ការរិចរិល និងការបំបែកគំរូទិន្នផលគឺសម្រាប់ការលាយបញ្ចូលគ្នាយ៉ាងហ្មត់ចត់ដែលសម្រាប់ការចេញផ្សាយពេញលេញ និងពេញលេញនៃ RNA ។កោសិកាអាចត្រូវបានធ្វើឱ្យដូចគ្នាដោយផ្ទាល់ដោយមិនខូច។ជាលិកាអាចត្រូវបានធ្វើឱ្យដូចគ្នាតែបន្ទាប់ពីបែក។ផ្សិត និងបាក់តេរីត្រូវបំបែកជាមួយនឹងអង់ស៊ីមដែលត្រូវគ្នា មុនពេលពួកវាអាចធ្វើដូចគ្នាបាន។ជាលិកាដែលមានមាតិកាអង់ស៊ីម endogenous ទាប និងមានភាពដូចគ្នាកាន់តែងាយស្រួលអាចត្រូវបានកំទេច និងធ្វើឱ្យដូចគ្នាក្នុងពេលតែមួយនៅក្នុង lysate ដោយ homogenizer មួយ។ជាលិការុក្ខជាតិ, ថ្លើម, ទីមុស, លំពែង, លំពែង, ខួរក្បាល, ខ្លាញ់, ជាលិកាសាច់ដុំ និងសំណាកផ្សេងទៀត, ពួកវាមានអង់ស៊ីម endogenous ខ្ពស់ ឬមិនងាយធ្វើដូចគ្នា,ដូច្នេះការរអាក់រអួលជាលិកា និងការធ្វើឱ្យដូចគ្នាត្រូវតែអនុវត្តដោយឡែកពីគ្នា។.វិធីសាស្រ្តដែលអាចទុកចិត្តបំផុត និងផលិតភាពបំផុតនៃការបំបែកគឺការកិនជាមួយអាសូតរាវ ហើយវិធីសាស្ត្រដែលអាចទុកចិត្តបំផុតនៃភាពដូចគ្នាគឺការប្រើម៉ាស៊ីនអេឡិចត្រិច។កំណត់ចំណាំពិសេសអំពីការកិនជាមួយអាសូតរាវ៖ គំរូមិនត្រូវរលាយក្នុងកំឡុងដំណើរការកិនទាំងមូលទេ ព្រោះអង់ស៊ីម endogenous ទំនងជាដំណើរការនៅពេលកក។

ការជ្រើសរើសលីសាត

ប៉ះពាល់ដល់ភាពងាយស្រួលនៃប្រតិបត្តិការ និងកត្តានៃភាពមិនបរិសុទ្ធ endogenous សំណល់ ដំណោះស្រាយ lysis ដែលគេប្រើជាទូទៅស្ទើរតែអាចរារាំងសកម្មភាពរបស់ RNase ។ដូច្នេះចំណុចសំខាន់នៃការជ្រើសរើសដំណោះស្រាយលីហ្សីគឺត្រូវពិចារណារួមផ្សំជាមួយវិធីសាស្ត្របន្សុត។មានករណីលើកលែងមួយ៖សំណាកដែលមានមាតិកាអង់ស៊ីម endogenous ខ្ពស់ត្រូវបានណែនាំអោយប្រើ lysate ដែលមានផ្ទុក phenol ដើម្បីបង្កើនសមត្ថភាពក្នុងការធ្វើឱ្យអង់ស៊ីម endogenous អសកម្ម។

ជម្រើសនៃវិធីសាស្ត្រសំអាត

កត្តាដែលប៉ះពាល់ដល់ភាពមិនបរិសុទ្ធដែលនៅសេសសល់ ល្បឿននៃការស្រង់ចេញ សម្រាប់សំណាកស្អាតដូចជាកោសិកា លទ្ធផលជាទីគាប់ចិត្តអាចទទួលបានជាមួយនឹងវិធីសាស្រ្តបន្សុតស្ទើរតែទាំងអស់នៅនឹងដៃ។ប៉ុន្តែសម្រាប់សំណាកជាច្រើនផ្សេងទៀត ជាពិសេសអ្នកដែលមានកម្រិតខ្ពស់នៃសារធាតុមិនបរិសុទ្ធ ដូចជារុក្ខជាតិ ថ្លើម បាក់តេរី ជាដើម ការជ្រើសរើសវិធីសាស្ត្របន្សុតសមរម្យគឺមានសារៈសំខាន់ណាស់។វិធីសាស្ត្របន្សុត centrifugal ជួរឈរមានល្បឿនទាញយកលឿន ហើយអាចកម្ចាត់ចោលនូវភាពមិនស្អាតដែលប៉ះពាល់ដល់ប្រតិកម្មអង់ស៊ីមជាបន្តបន្ទាប់នៃ RNA ប៉ុន្តែវាមានតម្លៃថ្លៃ (Foregene អាចផ្តល់នូវកញ្ចប់ដែលមានប្រសិទ្ធភាព ព័ត៌មានលម្អិតបន្ថែមសូមចុចនៅទីនេះ);ដោយប្រើវិធីសាស្រ្តបន្សុតបែបសន្សំសំចៃ និងបុរាណ ដូចជាទឹកភ្លៀង LiCl ក៏អាចទទួលបានលទ្ធផលជាទីគាប់ចិត្តដែរ ប៉ុន្តែរយៈពេលប្រតិបត្តិការគឺយូរ។.

"វិន័យបីនិងការយកចិត្តទុកដាក់ប្រាំបី" សម្រាប់ការស្រង់ចេញ RNA

វិន័យ ១៖បញ្ចប់ការចម្លងរោគនៃអង់ស៊ីម exogenous ។

ចំណាំ 1:ពាក់ម៉ាស និងស្រោមដៃយ៉ាងតឹងរ៉ឹង។

ចំណាំ 2:បំពង់ centrifuge, ក្បាល Tip, pipette rods, electrophoresis tanks និង benches ពាក់ព័ន្ធក្នុងការពិសោធន៍គួរតែត្រូវបានគេបោះចោលយ៉ាងហ្មត់ចត់។

ចំណាំទី 3៖សារធាតុប្រតិកម្ម/ដំណោះស្រាយដែលពាក់ព័ន្ធនឹងការពិសោធន៍ ជាពិសេសទឹកត្រូវតែគ្មាន RNase ។

វិន័យ ២៖រារាំងសកម្មភាពនៃអង់ស៊ីម endogenous

ចំណាំទី ៤៖ជ្រើសរើសវិធីធ្វើដូចគ្នាដែលសមស្រប។

ចំណាំ 5:ជ្រើសរើស lysate សមស្រប។

ចំណាំ 6:គ្រប់គ្រងបរិមាណចាប់ផ្តើមនៃគំរូ។

វិន័យ ៣៖បញ្ជាក់គោលបំណងទាញយករបស់អ្នក។

ចំណាំ 7:ជាមួយនឹងប្រព័ន្ធ lysate ណាមួយដែលខិតជិតចំនួនអតិបរមានៃគំរូចាប់ផ្តើម អត្រាជោគជ័យនៃការស្រង់ចេញធ្លាក់ចុះយ៉ាងខ្លាំង។

ចំណាំ 8:លក្ខណៈវិនិច្ឆ័យសេដ្ឋកិច្ចតែមួយគត់សម្រាប់ការទាញយក RNA ជោគជ័យគឺជោគជ័យក្នុងការពិសោធន៍ជាបន្តបន្ទាប់ មិនមែនទិន្នផលទេ។

ប្រភពកំពូលទាំង 10 នៃការចម្លងរោគ RNase

1. ម្រាមដៃគឺជាប្រភពដំបូងនៃអង់ស៊ីម exogenous ដូច្នេះស្រោមដៃត្រូវតែពាក់ និងជំនួសញឹកញាប់។លើសពីនេះ របាំងមុខក៏ត្រូវតែពាក់ដែរ ព្រោះការដកដង្ហើមក៏ជាប្រភពសំខាន់នៃអង់ស៊ីមផងដែរ។អត្ថប្រយោជន៍បន្ថែមនៃការពាក់ស្រោមដៃគឺដើម្បីការពារអ្នកពិសោធន៍។

2. គន្លឹះ Pipette, centrifuge tubes, pipettes – RNase មិនអាចអសកម្មដោយការក្រៀវតែឯងទេ ដូច្នេះគន្លឹះ pipette និង centrifuge tubes គួរតែត្រូវបានព្យាបាលដោយ DEPC ទោះបីជាពួកគេត្រូវបានសម្គាល់ថា DEPC ត្រូវបានព្យាបាលក៏ដោយ។វាជាការល្អបំផុតក្នុងការប្រើបំពង់ទឹកដែលមានគោលបំណងពិសេស ជូតវាជាមួយនឹងកប្បាសដែលមានជាតិអាល់កុល 75% មុនពេលប្រើប្រាស់ ជាពិសេសដំបង។លើសពីនេះ ត្រូវប្រាកដថាមិនត្រូវប្រើឧបករណ៍ដកក្បាល។

3. ទឹក/សតិបណ្ដោះអាសន្នត្រូវតែគ្មានការចម្លងរោគ RNase ។

4. យ៉ាងហោចណាស់ តារាងតេស្តគួរត្រូវបានជូតឱ្យស្អាតជាមួយនឹងគ្រាប់កប្បាសដែលមានជាតិអាល់កុល 75%។

5.Endogenous RNase ជាលិកាទាំងអស់មានអង់ហ្ស៊ីម endogenous ដូច្នេះការបង្កកជាលិកាយ៉ាងឆាប់រហ័សជាមួយនឹងអាសូតរាវគឺជាមធ្យោបាយដ៏ល្អបំផុតដើម្បីកាត់បន្ថយការរិចរិល។វិធីសាស្ត្ររក្សាទុក/កិនអាសូតរាវគឺពិតជាមិនងាយស្រួលទេ ប៉ុន្តែវាគឺជាមធ្យោបាយតែមួយគត់សម្រាប់ជាលិកាដែលមានកម្រិតខ្ពស់នៃអង់ស៊ីម endogenous ។

6. គំរូ RNA ផលិតផលទាញយក RNA អាចមានដាននៃការចម្លងរោគ RNase ។

7. ការទាញយកផ្លាស្មីត ការទាញយកផ្លាស្មីតជារឿយៗប្រើ Rnase ដើម្បីបង្ខូច RNA ហើយ Rnase ដែលនៅសល់គួរតែត្រូវបានរំលាយជាមួយ Proteinase K និងស្រង់ចេញដោយ PCI ។

8. ការផ្ទុក RNA ទោះបីជាវាត្រូវបានរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាពទាបក៏ដោយ បរិមាណដាននៃ RNase នឹងបណ្តាលឱ្យមានការរិចរិល RNA ។ដំណោះស្រាយដ៏ល្អបំផុតសម្រាប់ការរក្សាទុករយៈពេលវែងនៃ RNA គឺការព្យួរអំបិល/ជាតិអាល់កុល ពីព្រោះគ្រឿងស្រវឹងរារាំងសកម្មភាពអង់ស៊ីមទាំងអស់នៅសីតុណ្ហភាពទាប។

9. នៅពេលដែល cations (Ca, Mg) មានអ៊ីយ៉ុងទាំងនេះ ការឡើងកំដៅនៅសីតុណ្ហភាព 80C រយៈពេល 5 នាទីនឹងធ្វើឱ្យ RNA ត្រូវបាន cleaved ដូច្នេះប្រសិនបើ RNA ត្រូវការកំដៅ ដំណោះស្រាយអភិរក្សត្រូវមានសារធាតុ chelating (1mM Sodium Citrate, pH 6.4) ។

10. អង់ស៊ីមដែលប្រើក្នុងការពិសោធន៍ជាបន្តបន្ទាប់អាចមានការបំពុលដោយ RNase ។

10 គន្លឹះសម្រាប់ការស្រង់ចេញ RNA

1: ទប់ស្កាត់សកម្មភាព RNase យ៉ាងឆាប់រហ័ស។គំរូត្រូវបានកកភ្លាមៗបន្ទាប់ពីការប្រមូល ហើយ RNase ត្រូវបានអសកម្មដោយប្រតិបត្តិការរហ័សកំឡុងពេល lysis ។

2: ជ្រើសរើសវិធីសាស្ត្រស្រង់ចេញដែលសមស្របសម្រាប់ជាលិកាដែលមានមាតិកា ribozyme ខ្ពស់ ហើយជាលិកា adipose គឺល្អបំផុតដើម្បីប្រើវិធីសាស្ត្រដែលមានផ្ទុកសារធាតុ phenol ។

3: គុណភាពនៃការទស្សន៍ទាយតម្រូវឱ្យភាគខាងជើង ការសាងសង់បណ្ណាល័យ cDNA ទាមទារភាពសុចរិតខ្ពស់ ហើយ RT-PCR និង RPA (ការវិភាគការពារ Ribonuclease) មិនតម្រូវឱ្យមានភាពសុចរិតខ្ពស់នោះទេ។RT-PCR ទាមទារភាពបរិសុទ្ធខ្ពស់ (សំណល់អង់ស៊ីម inhibitor) ។

៤៖ ភាពដូចគ្នាហ្មត់ចត់ គឺជាគន្លឹះក្នុងការធ្វើឲ្យប្រសើរឡើងនូវទិន្នផល និងកាត់បន្ថយការរិចរិល។

5: ពិនិត្យមើលភាពសុចរិតនៃការរកឃើញ RNA electrophoresis, 28S: 18S = 2: 1 គឺជាសញ្ញាពេញលេញ, 1: 1 ក៏អាចទទួលយកបានសម្រាប់ការពិសោធន៍ភាគច្រើន។

៦៖ ការដក DNA សម្រាប់ RT-PCR ការវិភាគអារេ វាជាការល្អបំផុតក្នុងការប្រើ Dnase I ដើម្បីលុប DNA ។

៧៖ កាត់បន្ថយការចម្លងរោគនៃអង់ស៊ីម exogenous – អង់ស៊ីមមិនអាចនាំចូលពីខាងក្រៅបានទេ។

៨៖ នៅពេលប្រមូលផ្តុំអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីកដែលមានកំហាប់ទាប សារធាតុប្រឆាំងទឹកភ្លៀងគួរតែត្រូវបានបន្ថែម។ប៉ុន្តែ​ដើម្បី​ទប់ស្កាត់​ការ​ចម្លង​មេរោគ​ដែល​មាន​អង់ស៊ីម និង DNA ។

៩៖ រំលាយ RNA ឱ្យបានហ្មត់ចត់ បើចាំបាច់ កំដៅនៅ 65C រយៈពេល 5 នាទី។

វិធីសាស្រ្តផ្ទុកសមរម្យ

វាអាចត្រូវបានរក្សាទុកនៅ -20C ក្នុងរយៈពេលខ្លី និងនៅ -80C ក្នុងរយៈពេលយូរ។ជំហានដំបូងក្នុងការធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងនូវទិន្នផល RNA គឺត្រូវដឹងថាខ្លឹមសារ RNA នៃគំរូផ្សេងៗគ្នាប្រែប្រួលយ៉ាងខ្លាំង។បរិបូរណ៍ខ្ពស់ (2-4ug/mg) ដូចជា ថ្លើម លំពែង បេះដូង បរិមាណមធ្យម (0.05-2ug/mg) ដូចជាខួរក្បាល អំប្រ៊ីយ៉ុង តម្រងនោម សួត thymus អូវែ ភាពសម្បូរបែបទាប (<0.05ug/mg) mg) ដូចជា ប្លោកនោម ឆ្អឹង ខ្លាញ់។

1: កោសិកា Lyse ដើម្បីបញ្ចេញ RN – ប្រសិនបើ RNA មិនត្រូវបានបញ្ចេញទេ ទិន្នផលនឹងត្រូវបានកាត់បន្ថយ។ភាពដូចគ្នានៃអគ្គិសនីដំណើរការល្អជាងវិធីសាស្ត្រធ្វើដូចគ្នាផ្សេងទៀត ប៉ុន្តែប្រហែលជាត្រូវផ្សំជាមួយវិធីសាស្ត្រផ្សេងទៀតផងដែរ ដូចជាការកិនអាសូតរាវ ការរំលាយអង់ស៊ីម (Lysozyme/Lyticase)

2: ការបង្កើនប្រសិទ្ធភាពនៃវិធីសាស្ត្រស្រង់ចេញ។បញ្ហាដ៏ធំបំផុតជាមួយនឹងវិធីសាស្រ្តដែលមានមូលដ្ឋានលើ phenol គឺការធ្វើមាត្រដ្ឋានមិនពេញលេញ និងការបាត់បង់ RNA មួយផ្នែក (អតិផរណាមិនអាចដកចេញបានទាំងស្រុង)។ការដាក់កម្រិតមិនពេញលេញគឺដោយសារតែអាស៊ីត nucleic និងមាតិកាប្រូតេអ៊ីនខ្ពស់ ដែលអាចដោះស្រាយបានដោយការបង្កើនបរិមាណ lysate ដែលប្រើ ឬកាត់បន្ថយបរិមាណសំណាក។ជំហាននៃការទាញយក chloroform ត្រូវបានបន្ថែមទៅជាលិកា adipose ។ការបាត់បង់ RNA អាចត្រូវបានកាត់បន្ថយដោយការបូមត្រឡប់មកវិញ ឬដោយការយកចេញនូវស្រទាប់សរីរាង្គដែលតាមពីក្រោយដោយ centrifugation ។បញ្ហាដ៏ធំបំផុតជាមួយនឹងវិធីសាស្រ្តផ្អែកលើការ centrifugation ជួរឈរគឺជាគំរូលើស។

គន្លឹះស្រង់ចេញបុរាណ

1. ការបន្សុត Phenol: បន្ថែមបរិមាណស្មើគ្នានៃ 1: 1 Phenol/Chloroform ហើយលាយយ៉ាងខ្លាំងក្លារយៈពេល 1-2 នាទី។Centrifuge ក្នុងល្បឿនលឿនរយៈពេល 2 នាទី។យក supernatant ចេញដោយប្រុងប្រយ័ត្ន (80-90%) ។កុំឈានដល់ស្រទាប់កណ្តាល។បរិមាណស្មើគ្នានៃដំណោះស្រាយប្រតិកម្មអាចត្រូវបានបន្ថែមទៅ Phenol/Chloroform ហើយសារធាតុ supernatant ត្រូវបានដកចេញ។ពពួក supernatants ទាំងពីរអាចត្រូវបានលាយបញ្ចូលគ្នាសម្រាប់ទឹកភ្លៀងអាស៊ីត nucleic ដើម្បីបង្កើនទិន្នផល។កុំ​ស្លូត​ពេក​ពេល​លាយ ហើយ​កុំ​ព្យាយាម​ដក​អតិសុខុមប្រាណ​ទាំង​អស់​ចេញ។

2. ការលាងសម្អាតជាមួយនឹងអេតាណុល 70-80%៖ ក្នុងអំឡុងពេលលាងសម្អាត អាស៊ីត nucleic ត្រូវតែផ្អាក ដើម្បីធានាថាអំបិលដែលនៅសេសសល់ត្រូវបានលាងសម្អាត។ក្នុងពេលជាមួយគ្នានេះ ភ្លាមៗបន្ទាប់ពីចាក់អេតាណុលរួច រំកិលកណ្តាលក្នុងល្បឿនលឿនរយៈពេលពីរបីវិនាទី ហើយបន្ទាប់មកយកអេតាណុលដែលនៅសេសសល់ចេញដោយប្រើបំពង់។រំលាយបន្ទាប់ពីឈរនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ 5-10 នាទី។

11. ការស្រង់ចេញនៃអង្គការពិសេស

1. ជាលិកាសរសៃ៖ គន្លឹះក្នុងការទាញយក RNA ចេញពីជាលិកាសរសៃ ដូចជាសាច់ដុំបេះដូង/គ្រោងឆ្អឹង គឺធ្វើឱ្យខូចជាលិកាទាំងស្រុង។ជាលិកាទាំងនេះមានដង់ស៊ីតេកោសិកាទាប ដូច្នេះបរិមាណ RNA ក្នុងមួយឯកតាទម្ងន់នៃជាលិកាមានកម្រិតទាប ហើយវាជាការល្អបំផុតក្នុងការប្រើប្រាស់បរិមាណចាប់ផ្តើមឱ្យបានច្រើនតាមដែលអាចធ្វើទៅបាន។ត្រូវប្រាកដថាកិនជាលិកាយ៉ាងហ្មត់ចត់នៅក្រោមលក្ខខណ្ឌត្រជាក់។

2. ជាលិកាដែលមានមាតិកាប្រូតេអ៊ីន / ខ្លាញ់ខ្ពស់៖ មាតិកាខ្លាញ់នៃខួរក្បាល / បន្លែគឺខ្ពស់។បន្ទាប់ពីការទាញយក PCI, supernatant មាន floccules ពណ៌ស។supernatant ត្រូវតែត្រូវបានស្រង់ចេញម្តងទៀតជាមួយនឹង chloroform ។

3. ជាលិកាដែលមានអាស៊ីត nucleic/ribozyme ខ្ពស់៖ spleen/thymus មានអាស៊ីត nucleic និង ribozyme ខ្ពស់។ការ​កិន​ជាលិកា​ក្រោម​លក្ខខណ្ឌ​ត្រជាក់​តាម​ពីក្រោយ​ដោយ​ការ​ធ្វើ​ឲ្យ​ដូចគ្នា​លឿន​អាច​ធ្វើ​ឲ្យ​ Ribozymes អសកម្ម​បាន​យ៉ាង​មាន​ប្រសិទ្ធភាព។ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយ ប្រសិនបើ lysate មាន viscous ពេក (ដោយសារតែមាតិកាអាស៊ីត nucleic ខ្ពស់) ការទាញយក PCI នឹងមិនអាច stratify ប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាពទេ។ការបន្ថែម lysate បន្ថែមទៀតអាចដោះស្រាយបញ្ហានេះបាន។ការទាញយក PCI ច្រើនអាចយក DNA ដែលនៅសល់ចេញបាន។ប្រសិនបើទឹកភ្លៀងពណ៌សកើតឡើងភ្លាមៗបន្ទាប់ពីបន្ថែមជាតិអាល់កុល វាបង្ហាញពីការចម្លងរោគ DNA ។ការស្រង់ចេញឡើងវិញជាមួយនឹងអាស៊ីត PCI បន្ទាប់ពីការរំលាយអាចលុបការចម្លងរោគ DNA ។

4. ជាលិការុក្ខជាតិ៖ ជាលិការុក្ខជាតិមានភាពស្មុគស្មាញជាងជាលិកាសត្វ។ជាទូទៅ រុក្ខជាតិត្រូវបានដីក្រោមលក្ខខណ្ឌអាសូតរាវ ដូច្នេះការរិចរិល RNA ដោយអង់ស៊ីម endogenous គឺមិនធម្មតាទេ។ប្រសិនបើបញ្ហានៃការរិចរិលមិនត្រូវបានដោះស្រាយទេ វាស្ទើរតែប្រាកដជាបណ្តាលមកពីភាពមិនបរិសុទ្ធដែលមាននៅក្នុងគំរូ។ភាពមិនបរិសុទ្ធដែលមាននៅក្នុងរុក្ខជាតិជាច្រើននឹងនាំទៅរកសំណល់ ហើយមូលហេតុនៃសំណល់ច្រើនតែដោយសារតែភាពមិនបរិសុទ្ធទាំងនេះមានភាពស្រដៀងគ្នាមួយចំនួនជាមួយ RNA៖ អ្នក precipitate ហើយខ្ញុំ precipitate ហើយអ្នក adsorb ហើយខ្ញុំ adsorb ។លក្ខណៈទាំងនេះកំណត់ថាពួកវាជាអង់ស៊ីម inhibitors ខ្លាំង។

នាពេលបច្ចុប្បន្ននេះ សារធាតុចម្រាញ់យក RNA ពាណិជ្ជកម្មអាចត្រូវបានសម្របទៅនឹងជាលិកាសត្វស្ទើរតែទាំងអស់ជាមួយនឹងការកែតម្រូវតិចតួច ប៉ុន្តែមានសារធាតុចម្រាញ់យក RNA ពាណិជ្ជកម្មតិចតួចដែលអាចសមរម្យសម្រាប់ជាលិការុក្ខជាតិភាគច្រើន។ជាសំណាងល្អ Foregene អាចផ្តល់ពិសេសឧបករណ៍ទាញយក RNA រុក្ខជាតិ, យើង​មានPlant Total RNA Isolation Kit, Plant Total RNA Isolation Kit Plus.ក្រោយមកទៀតត្រូវបានរចនាឡើងជាពិសេសសម្រាប់រុក្ខជាតិដែលមានសារធាតុ polysaccharide និង polyphenol ខ្ពស់។សម្រាប់ការទាញយក RNA មតិអ្នកប្រើពីមន្ទីរពិសោធន៍គឺល្អជាពិសេស។

12. ឥទ្ធិពលនៃការបង្កកគំរូ និងការរលាយ គំរូដែលកកអាចមានទំហំធំជាង ហើយវាត្រូវការកាត់មុនពេលប្រើសម្រាប់ការទាញយក RNA ។គំរូមាននិន្នាការរលាយ (អាចដោយផ្នែក) កំឡុងពេលកាត់។សំណាកដែលកកអាចនឹងត្រូវថ្លឹងមុនពេលការទាញយក RNA ហើយការរលាយនឹងកើតឡើងក្នុងអំឡុងពេលដំណើរការនេះ។ជួនកាលការរលាយនៃសំណាកក៏កើតឡើងក្នុងអំឡុងពេលដំណើរការកិនអាសូតរាវ។ឬសំណាកដែលកកត្រូវបានបន្ថែមដោយផ្ទាល់ទៅ lysate ដោយមិនមានការកិនអាសូតរាវ ហើយការរលាយនឹងពិតជាកើតឡើងមុនពេលការធ្វើឱ្យដូចគ្នាទាំងស្រុង។ការពិសោធន៍បានបង្ហាញថាជាលិកាដែលកកគឺងាយនឹងការរិចរិល RNA កំឡុងពេលរលាយជាងជាលិកាស្រស់។ហេតុផលដែលទំនង៖ ដំណើរការបង្កកធ្វើឱ្យរំខានដល់រចនាសម្ព័ន្ធនៅក្នុងកោសិកា ធ្វើឱ្យវាកាន់តែងាយស្រួលសម្រាប់អង់ស៊ីម endogenous ចូលមកក្នុងទំនាក់ទំនងផ្ទាល់ជាមួយ RNA ។

13. ការវិនិច្ឆ័យគុណភាព RNA ជាធម្មតា electrophoresis ត្រូវបានប្រើដើម្បីវិនិច្ឆ័យភាពសុចរិតនៃ RNA ហើយ A260/A280 ត្រូវបានប្រើដើម្បីវិនិច្ឆ័យភាពបរិសុទ្ធនៃ RNA ។តាមទ្រឹស្តី RNA ដដែលមានសមាមាត្រ 28S:18S = 2.7:1 ហើយទិន្នន័យភាគច្រើនសង្កត់ធ្ងន់លើសមាមាត្រនៃ 28S:18S = 2:1។ការពិតគឺថាស្ទើរតែគ្មាន RNA ដែលស្រង់ចេញពីសំណាកក្រៅពីកោសិកាគឺស្ថិតនៅក្នុងសមាមាត្រ 2: 1 (នេះត្រូវបានទទួលដោយប្រើ Agilent Bioanalyzer)។

លទ្ធផល electrophoresis នៃ RNA ត្រូវបានប៉ះពាល់ដោយកត្តាជាច្រើន រួមទាំងរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំ លក្ខខណ្ឌ electrophoresis ការផ្ទុកគំរូ កម្រិតនៃការតិត្ថិភាពដោយ EB ជាដើម។ ប្រើ electrophoresis ដើមដើម្បីរកឃើញ RNA និងប្រើ DNA Marker ជាវត្ថុបញ្ជា។ប្រសិនបើ 28S នៅ 2kb និង 18S នៅ 0.9kb គឺច្បាស់ ហើយ 28S: 18S > 1 ភាពសុចរិតអាចបំពេញតាមតម្រូវការនៃការពិសោធន៍ជាបន្តបន្ទាប់ភាគច្រើន។

A260/A280 គឺជាសូចនាករដែលបណ្តាលឱ្យមានការភ័ន្តច្រឡំជាច្រើន។ជាដំបូងវាចាំបាច់ដើម្បីបញ្ជាក់អត្ថន័យដើមនៃសូចនាករនេះសម្រាប់អាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីក: RNA សុទ្ធ A260/280 របស់វា = ប្រហែល 2.0 ។RNA សុទ្ធគឺជា 'មូលហេតុ' ហើយ A260/A280 = 2 គឺជា 'ផលប៉ះពាល់' ។ឥឡូវនេះមនុស្សគ្រប់គ្នាកំពុងប្រើ A260/A280 ជា 'បុព្វហេតុ' ដោយគិតថា "ប្រសិនបើ A260 / A280 = 2 នោះ RNA គឺសុទ្ធ" ដែលធម្មជាតិនាំឱ្យមានការភាន់ច្រលំ។

ប្រសិនបើអ្នកចាប់អារម្មណ៍ អ្នកអាចបន្ថែមសារធាតុប្រតិកម្មតិចតួចដែលជារឿយៗត្រូវបានប្រើប្រាស់ក្នុងការស្រង់ចេញ ដូចជា phenol, guanidine isothiocyanate, PEG ជាដើម ទៅសំណាក RNA របស់អ្នក ហើយបន្ទាប់មកវាស់សមាមាត្រ A260/A280 ។ការពិតគឺថាសារធាតុជាច្រើនដែលប្រើសម្រាប់ការទាញយក RNA ក៏ដូចជាភាពមិនបរិសុទ្ធជាច្រើននៅក្នុងគំរូ ស្រូបយកជុំវិញ A260 និង A280 ដែលប៉ះពាល់ដល់ A260/A280 ។

វិធីសាស្រ្តណែនាំបំផុតនាពេលបច្ចុប្បន្នគឺការស្កេនសំណាក RNA ក្នុងជួរ 200-300 nm ។ខ្សែកោងនៃ RNA សុទ្ធមានលក្ខណៈដូចខាងក្រោមៈ ខ្សែកោងរលោង A230 និង A260 គឺជាចំណុចបញ្ឆេះពីរ A300 នៅជិត 0 A260/A280 = ជុំវិញ 2.0 និង A260/A230 = ជុំវិញ 2.0 ។ប្រសិនបើទិន្នន័យស្កែនមិនមានទេ សមាមាត្រ A260/A230 ត្រូវតែកំណត់ផងដែរ ព្រោះសមាមាត្រនេះមានភាពរសើបជាងមុនចំពោះការដឹកជញ្ជូនសារធាតុមិនបរិសុទ្ធទាំងអស់ដែលប៉ះពាល់ដល់ប្រតិកម្មអង់ស៊ីម។យកទៅក្នុងគណនីជួរលីនេអ៊ែរនៃឧបករណ៍ (0.1-0.5 សម្រាប់ A260) ។

មានបាតុភូតមានប្រយោជន៍ពីរផ្សេងទៀត៖ សមាមាត្រនឹងទាបជាង 0.3 នៅពេលដែល A260/A280 ត្រូវបានវាស់នៅក្នុងទឹក;ខណៈពេលដែលសមាមាត្រដែលបានវាស់នៅក្នុង 10 mM EDTA គឺប្រហែល 0.2 ខ្ពស់ជាងការវាស់វែងក្នុង 1 mM EDTA ។

ផលិតផលដែលពាក់ព័ន្ធ៖

រោងចក្រចិន Total RNA Isolation Kit ក្រុមហ៊ុនផលិត និងផ្គត់ផ្គង់ |Foregene (foreivd.com)

ស៊េរីឯកោ RNA អ្នកផ្គត់ផ្គង់ និងរោងចក្រ |ក្រុមហ៊ុនផលិតស៊េរីដាច់ដោយឡែក RNA របស់ប្រទេសចិន (foreivd.com)

ស៊េរីភាពឯកោ RNA – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)