យើងជាអ្នកផលិតដែលមានបទពិសោធន៍។ការឈ្នះភាគច្រើននៅក្នុងវិញ្ញាបនប័ត្រដ៏សំខាន់នៃទីផ្សាររបស់ខ្លួនសម្រាប់ការបញ្ចុះតម្លៃដ៏ធំរបស់ប្រទេសចិន ការស៊ើបអង្កេតមួយជំហានកម្រិតខ្ពស់ Rt-QpcrKit V2, Quality is factory' life, focus on customer' demand is the source of company survival and development, We adhere to honesty and good faith working attitude , ទន្ទឹងរង់ចាំការមកដល់របស់អ្នក !
យើងជាអ្នកផលិតដែលមានបទពិសោធន៍។ការឈ្នះភាគច្រើននៅក្នុងការបញ្ជាក់សំខាន់នៃទីផ្សាររបស់ខ្លួនសម្រាប់ចិន Taq DNA Polymerase, Qpcr, ក្រុមហ៊ុនរបស់យើងសន្យាថា: តម្លៃសមហេតុផល, ពេលវេលាផលិតខ្លីនិងពេញចិត្តសេវាកម្មបន្ទាប់ពីការលក់, យើងក៏ស្វាគមន៍អ្នកមកទស្សនារោងចក្ររបស់យើងនៅពេលណាក៏បានដែលអ្នកចង់បាន។សូមជូនពរឱ្យរកស៊ីមានបាន និងយូរអង្វែងជាមួយគ្នា!!!

ការពិពណ៌នា

ឧបករណ៍នេះប្រើប្រព័ន្ធសតិបណ្ដោះអាសន្ន lysis តែមួយគត់ដែលអាចបញ្ចេញ RNA យ៉ាងឆាប់រហ័សពីគំរូកោសិកាវប្បធម៌សម្រាប់ប្រតិកម្ម RT-qPCR ដោយហេតុនេះការលុបបំបាត់ដំណើរការបន្សុត RNA ដែលចំណាយពេលវេលា និងកម្លាំងពលកម្ម។គំរូ RNA អាចទទួលបានក្នុងរយៈពេលត្រឹមតែ 7 នាទីប៉ុណ្ណោះ។សារធាតុប្រតិកម្ម 5×Direct RT Mix និង 2×Direct qPCR Mix-SYBR ដែលផ្តល់ដោយឧបករណ៍អាចទទួលបានលទ្ធផល PCR បរិមាណតាមពេលវេលាជាក់ស្តែង និងឆាប់រហ័ស។

5 × Direct RT Mix និង 2 × Direct qPCR Mix-SYBR មានភាពអត់ធ្មត់ខ្លាំង ហើយ lysate នៃសំណាកអាចត្រូវបានប្រើជាគំរូសម្រាប់ RT-qPCR ដោយផ្ទាល់។ឧបករណ៍នេះមានផ្ទុកនូវ RNA reverse transcriptase ដែលមានទំនាក់ទំនងខ្ពស់តែមួយគត់របស់ Foregene និង Hot D-Taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl₂សតិបណ្ដោះអាសន្នប្រតិកម្ម ឧបករណ៍បង្កើនប្រសិទ្ធភាព PCR និងស្ថេរភាព។

លក្ខណៈបច្ចេកទេស

200 × 20μl Rxns, 1000 × 20μl Rxns

សមាសធាតុនៃកញ្ចប់

លក្ខណៈពិសេស & គុណសម្បត្តិ

■ សាមញ្ញ និងមានប្រសិទ្ធភាព៖ ជាមួយនឹងបច្ចេកវិទ្យា Cell Direct RT គំរូ RNA អាចទទួលបានក្នុងរយៈពេលត្រឹមតែ 7 នាទីប៉ុណ្ណោះ។

■ តំរូវការគំរូគឺតូច ដែលអាចសាកល្បងបាន 10 កោសិកា។

■ ការបញ្ជូនថាមពលខ្ពស់៖ វាអាចរកឃើញ RNA យ៉ាងឆាប់រហ័សនៅក្នុងកោសិកាដែលត្រូវបានដាំដុះក្នុង 384, 96, 24, 12, 6-well plates ។

■ DNA Eraser អាចលុបហ្សែនដែលបានចេញផ្សាយយ៉ាងឆាប់រហ័ស កាត់បន្ថយផលប៉ះពាល់យ៉ាងខ្លាំងទៅលើលទ្ធផលពិសោធន៍ជាបន្តបន្ទាប់។

■ ប្រព័ន្ធ RT និង qPCR ដែលត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងធ្វើឱ្យការចម្លងបញ្ច្រាស RT-PCR ពីរជំហានកាន់តែមានប្រសិទ្ធភាព និង PCR កាន់តែជាក់លាក់ និងធន់នឹងថ្នាំទប់ស្កាត់ប្រតិកម្ម RT-qPCR ។

កម្មវិធីកញ្ចប់

វិសាលភាពនៃការអនុវត្ត៖ កោសិកាដាំដុះ។

- RNA បញ្ចេញដោយ លីហ្សីសគំរូ៖ អាចអនុវត្តបានតែចំពោះគំរូ RT-qPCR នៃឧបករណ៍នេះប៉ុណ្ណោះ។

- ឧបករណ៍នេះអាចត្រូវបានប្រើសម្រាប់គោលបំណងដូចខាងក្រោមៈ ការវិភាគការបញ្ចេញហ្សែន ការផ្ទៀងផ្ទាត់ប្រសិទ្ធភាពនៃការបំបិទហ្សែនដែលសម្របសម្រួលដោយ siRNA ការពិនិត្យថ្នាំ។ល។

ដ្យាក្រាម

ការផ្ទុកនិងអាយុកាលធ្នើ

ផ្នែក I នៃកញ្ចប់នេះគួរតែត្រូវបានរក្សាទុកនៅ 4 ℃;ផ្នែកទី II គួរតែត្រូវបានរក្សាទុកនៅ -20 ℃។

Foregene Protease Plus II គួរតែត្រូវបានរក្សាទុកនៅ 4 ℃, កុំបង្កកនៅ -20 ℃។

សារធាតុ Reagent 2 × Direct qPCR Mix-SYBR គួរតែត្រូវបានរក្សាទុកនៅ -20 ℃ នៅក្នុងទីងងឹត។ប្រសិនបើប្រើញឹកញាប់ វាក៏អាចរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាព 4 ℃ សម្រាប់ការរក្សាទុករយៈពេលខ្លី (ប្រើក្នុងរយៈពេល 10 ថ្ងៃ)។ យើងជាអ្នកផលិតដែលមានបទពិសោធន៍។Wining the majority in the crucial certifications of its market for Big discounting China High Sensitivity One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2, Quality is factory' life , Focus on customer' demand is the source of company survival and development, We adhere to honesty and good faith working attitude, looking forward to your coming !
ការបញ្ចុះតម្លៃដ៏ធំចិន Taq DNA Polymerase, Qpcr, ក្រុមហ៊ុនរបស់យើងសន្យាថា: តម្លៃសមរម្យ, ពេលវេលាផលិតខ្លីនិងសេវាកម្មបន្ទាប់ពីការលក់ដែលពេញចិត្ត យើងក៏ស្វាគមន៍អ្នកមកទស្សនារោងចក្ររបស់យើងនៅពេលណាក៏បានដែលអ្នកចង់បាន។សូមជូនពរឱ្យរកស៊ីមានបាន និងយូរអង្វែងជាមួយគ្នា!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -តាកមan

Cat.No.DRT-01021/01022

សម្រាប់កោសិកាដោយផ្ទាល់ RT-qPCR ដោយប្រើកោសិកា ≤ 1000,000

ការណែនាំអំពីផលិតផល

ផលិតផលនេះប្រើប្រាស់ប្រព័ន្ធបណ្ដោះអាសន្ន lysis តែមួយគត់ដើម្បីបញ្ចេញ RNA យ៉ាងឆាប់រហ័សពីគំរូកោសិកាវប្បធម៌សម្រាប់ប្រតិកម្ម RT-qPCR លុបបំបាត់ដំណើរការបន្សុត RNA ដែលចំណាយពេលវេលា និងហត់នឿយ ហើយត្រឹមតែ 7 នាទីប៉ុណ្ណោះដើម្បីទទួលបានគំរូ RNA ដែលត្រូវការ ជាមួយនឹង 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman លទ្ធផលអាចទទួលបានយ៉ាងរហ័ស និងទាន់ពេលវេលា។

5× Direct RT Mix និង 2× Direct qPCR Mix-Taqman មានភាពអត់ធ្មត់ក្នុងការទប់ស្កាត់ខ្លាំង ហើយអាចអនុវត្តការបញ្ច្រាសប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាព និងការពង្រីកជាក់លាក់ដោយប្រើ lysate នៃគំរូដែលត្រូវវាស់ជាគំរូ។សារធាតុមានផ្ទុកសារធាតុ Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, Reaction Buffer, PCR Optimizer and Stabilizer ដែលអាចប្រើជាមួយ lysis buffer ដើម្បីស្វែងរកសំណាកបានយ៉ាងឆាប់រហ័ស និងងាយស្រួល ហើយមានលក្ខណៈនៃភាពប្រែប្រួលខ្ពស់ ភាពជាក់លាក់ និងស្ថេរភាព។

លក្ខណៈផលិតផល

បច្ចេកវិទ្យា Cell Direct RT ដ៏សាមញ្ញ និងមានប្រសិទ្ធភាព ដែលចំណាយពេលត្រឹមតែ 7 នាទីដើម្បីទទួលបានគំរូ RNA ។

តម្រូវការគំរូគឺតូច ហើយយ៉ាងហោចណាស់កោសិកាវប្បធម៌ចំនួន 10 អាចត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការពិសោធន៍។

ទិន្នផលខ្ពស់សម្រាប់ការទទួលបាន RNA យ៉ាងឆាប់រហ័សនៃកោសិកាវប្បធម៌ដូចជា 384, 96, 24, 12, និង 6-well plates ។

DNA Eraser អាច​លុប​ហ្សែន​ចេញ​បាន​យ៉ាង​ឆាប់​រហ័ស ដោយ​កាត់​បន្ថយ​ឥទ្ធិពល​លើ​លទ្ធផល​ពិសោធន៍​ជា​បន្ត​បន្ទាប់។

ប្រព័ន្ធ RT និង qPCR ដែលត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងធ្វើឱ្យ RT-PCR ពីរជំហានជាមួយនឹងការចម្លងបញ្ច្រាសកាន់តែមានប្រសិទ្ធភាព ភាពជាក់លាក់ និងការអត់ធ្មត់នៃប្រតិកម្ម RT-qPCR កាន់តែខ្លាំង។

កម្មវិធីកញ្ចប់

វិសាលភាពនៃការអនុវត្ត៖ កោសិកាដាំដុះ។

ការវិភាគគំរូបានបកស្រាយ RNA៖ ប្រើតែជាគំរូ RT-qPCR ពីរជំហានប៉ុណ្ណោះ។

កញ្ចប់អាចត្រូវបានប្រើសម្រាប់គោលបំណងដូចខាងក្រោមៈ ការវិភាគការបញ្ចេញមតិបទប្បញ្ញត្តិហ្សែន ការធ្វើតេស្ត allele ការពិនិត្យថ្នាំ។ល។

ការកំណត់កញ្ចប់

បំណែកពង្រីក ≤ 300 bp ។

កញ្ចប់ត្រូវបានប្រើប្រាស់ដើម្បីបណ្តុះកោសិកាថ្មីៗ។

ការត្រួតពិនិត្យគុណភាពផលិតផល

យោងតាមប្រព័ន្ធគ្រប់គ្រងគុណភាពសរុបរបស់ FOREGENE កញ្ចប់នីមួយៗនៃ Cell Direct RT-qPCR series kits ត្រូវបានធ្វើតេស្តយ៉ាងម៉ត់ចត់ជាច្រើនដង ដើម្បីធានាបាននូវភាពជឿជាក់ និងស្ថេរភាពនៃគុណភាពនៃកញ្ចប់នីមួយៗ។

មាតិកាកញ្ចប់

*:Cell Lysis, 5 × Direct RT Mix, 2 × Direct qPCR Mix-Taqman អាចត្រូវបានទិញដោយឡែកពីគ្នា ព័ត៌មានលម្អិតត្រូវបានផ្តល់ជូននៅក្នុងឧបសម្ព័ន្ធទី 1 (ទំព័រ 13) ។

លក្ខខណ្ឌផ្ទុក

1. លក្ខខណ្ឌដឹកជញ្ជូន

ដំណើរការទាំងមូលនៃការដឹកជញ្ជូនប្រអប់ទឹកកកដែលមានសីតុណ្ហភាពទាប ដើម្បីធានាថាឧបករណ៍នេះស្ថិតនៅក្នុងស្ថានភាព <4°C។

2. លក្ខខណ្ឌផ្ទុក

ទុកផ្នែក I នៅសីតុណ្ហភាព 4°C និងផ្នែកទី II នៅ -20°C។

Foregene Protease Plus II គួរតែត្រូវបានរក្សាទុកនៅ 4 ° C, មិនកកនៅ -20 ° C ។

Reagent 2 × Direct qPCR Mix-Taqman ត្រូវបានរក្សាទុកនៅ -20°C ឬនៅ 4°C សម្រាប់ការប្រើប្រាស់រយៈពេលខ្លី ប្រសិនបើប្រើញឹកញាប់ (ក្នុងរយៈពេល 10 ថ្ងៃ)។

ព័ត៌មានអំពីធាតុផ្សំនៃកញ្ចប់

Buffer CL: ផ្តល់បរិយាកាសដែលត្រូវការសម្រាប់ប្រតិកម្មកោសិកា។

Buffer ST: បញ្ឈប់សារធាតុសកម្មនៅក្នុង lysate ដើម្បីជៀសវាងផលប៉ះពាល់លើ RT ជាបន្តបន្ទាប់។

DNA Eraser: ឧបករណ៍លុប DNA ឥទ្ធិពលនៃការយកចេញនូវហ្សែននៅលើការពិសោធន៍ជាបន្តបន្ទាប់។

5 × Direct RT Mix៖ មានផ្ទុកនូវ RNA Reverse Transcriptase ដែលមានភាពស្និទ្ធស្នាលខ្ពស់, RNase Inhibitor, dNTPs, stabilizers, enhancers, optimizers, និង reverse transcription primers សម្រាប់ការតម្រឹមដ៏ល្អប្រសើរ (Random Primer, Oligo(dT))₁₈ថ្នាំ primer) ។

Foregene Protease Plus II: នៅក្នុងបរិបទនៃ lysis buffer កោសិកាត្រូវបាន lysed ដើម្បីបញ្ចេញអាស៊ីត nucleic ។

2× Direct qPCR Mix-Taqman៖ សារធាតុនេះមានផ្ទុកនូវ Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂សតិបណ្ដោះអាសន្នប្រតិកម្ម ឧបករណ៍បង្កើនប្រសិទ្ធភាព PCR និងស្ថេរភាព។

20 × ROX Reference Dye: ជាទូទៅត្រូវបានប្រើប្រាស់នៅលើឧបករណ៍ពង្រីក PCR ពេលវេលាពិតរបស់ ABI, Stratagene និងក្រុមហ៊ុនដទៃទៀត វាត្រូវបានគេប្រើដើម្បីកែតម្រូវភាពខុសគ្នារវាងបំពង់ PCR និងបំពង់ដែលបណ្តាលមកពីកំហុសក្នុងការចាក់ថ្នាំ PCR ។កំហាប់ 20× ROX Reference Dye ដែលត្រូវការសម្រាប់ឧបករណ៍ផ្សេងៗគឺខុសគ្នា ហើយអ្នកប្រើប្រាស់អាចបន្ថែមវាតាមកំហាប់ឧបករណ៍ដែលបានណែនាំ។

RNase-Free ddH₂O: ទឹកសុទ្ធដែលមិនមានការក្រៀវ RNase សម្រាប់ប្រតិកម្ម RT-qPCR ពីរជំហាន។

ការប្រុងប្រយ័ត្នជាមុន:(ត្រូវប្រាកដថាអានដោយប្រុងប្រយ័ត្នមុនពេលប្រើឧបករណ៍)

យកចិត្តទុកដាក់លើវិធីសាស្រ្តប្រតិបត្តិការនៃការពិសោធន៍ដើម្បីជៀសវាងការចម្លងរោគរវាងគំរូ។

យកចិត្តទុកដាក់លើភាពស្អាតនៃបរិស្ថានពិសោធន៍ និងឧបករណ៍ប្រើប្រាស់ ដើម្បីជៀសវាងការចម្លងរោគ RNase និងការរិចរិល RNA ។

យក​គំរូ​កោសិកា​ស្រស់ ឬ​ដែល​បាន​រក្សា​ទុក​ឱ្យ​បាន​ល្អ ហើយ​កុំ​ប្រើ​គំរូ​កោសិកា​ដែល​បាន​រលាយ​សាបសូន្យ​ម្តង​ហើយ​ម្តងទៀត។

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman គួរតែជៀសវាងការបង្កកម្តងហើយម្តងទៀត បើមិនដូច្នោះទេ វានឹងប៉ះពាល់ដល់ការចម្លងបញ្ច្រាស និងប្រសិទ្ធភាព PCR ។

ត្រៀមអាហារូបត្ថម្ភពីមុនប្រតិបត្តិការ

ត្រូវប្រាកដថាអានការណែនាំដោយប្រុងប្រយ័ត្នមុនពេលប្រើឧបករណ៍នេះ។ឧបករណ៍ Cell Direct RT-qPCR គឺសាមញ្ញ ងាយស្រួល និងរហ័សក្នុងការដំណើរការ ហើយការណែនាំផ្តល់ព័ត៌មានពេញលេញអំពីឧបករណ៍ទាំងមូល និងរបៀបប្រើវាឱ្យបានត្រឹមត្រូវ។សូមរៀបចំសម្ភារៈ និងឧបករណ៍ពិសោធន៍ចាំបាច់មុនពេលប្រើប្រាស់។

សម្ភារៈ និងឧបករណ៍ពិសោធន៍

◆កោសិកាវប្បធម៌។

◆ 1.5ml ឬ 2ml, RNase-/DNase-Free centrifuge tube, RNase-/DNase-Free tip, 0.2ml បំពង់ qPCR មាប់មគ។

◆ ម៉ាស៊ីន qPCR, pipette, tabletop centrifuge (≥១៣.៤០០×g) (អាស្រ័យលើតម្រូវការពិសោធន៍) ។ល។

សុវត្ថិភាព

◆ ផលិតផលនេះគឺសម្រាប់គោលបំណងស្រាវជ្រាវវិទ្យាសាស្ត្រតែប៉ុណ្ណោះ សូមកុំប្រើប្រាស់វាសម្រាប់គោលបំណងឱសថ គ្លីនិក អាហារ និងគ្រឿងសំអាង។

◆ នៅពេលប្រើសារធាតុគីមី សូមស្លៀកសម្លៀកបំពាក់មន្ទីរពិសោធន៍សមស្រប មដ វ៉ែនតាការពារ។ល។

ប្រតិបត្តិការមគ្គុទ្ទេសក៍

ប្រព័ន្ធ Cell Lysis ប្រព័ន្ធ RT និងកញ្ចប់បន្ថែមដំណោះស្រាយប្រតិកម្ម qPCR អាចត្រូវបានទិញដោយឡែកពីគ្នា សម្រាប់ព័ត៌មានលម្អិតនៅក្នុងឧបសម្ព័ន្ធទី 1 (ទំព័រ 13) ។

ការណែនាំអំពីប្រតិបត្តិការ

A: ការចេញផ្សាយ RNA គំរូ

1. កោសិកាត្រូវបានព្យាបាលជាមុន៖ លាងចានវប្បធម៌កោសិកាជាមួយ PBS ត្រជាក់ បន្ទាប់មក lyse កោសិកា (10-10⁶), ១០⁶ ជាងចំនួនកោសិកា វាត្រូវបានណែនាំអោយប្រើ Foregene the Cell an RNA Isolation Kit the Total (DE-03111) ឬ Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) សម្រាប់ការទាញយក និងការបន្សុត RNA ។

១.១.កោសិកាជាប់គ្នា (24- ចានអណ្តូងជាឧទាហរណ៍)

១.១.១.កំណត់ចំនួនក្រឡាក្នុងអណ្តូងនីមួយៗ កំណត់ថាចំនួនក្រឡាគឺ 1 × 10⁵ហើយប្រើបំពង់ដើម្បីយកឧបករណ៍ផ្ទុកវប្បធម៌ចេញពីចានវប្បធម៌។

១.១.២.បន្ថែម 200 μlនៃមុនត្រជាក់ 1 × PBS ទៅអណ្តូងនីមួយៗ។កុំដាក់បំពង់ម្តងហើយម្តងទៀត ហើយដក PBS ចេញពីអណ្តូង។ផ្អៀងចានហើយយក PBS ចេញតាមដែលអាចធ្វើទៅបាន។បន្តទៅជំហានទី 2 ។

១.១.៣.ចានវប្បធម៌កោសិកាផ្សេងៗគ្នា ឬតារាងលេខយោង 1-1 នៅក្នុងចានវប្បធម៌កោសិកាត្រូវបានបន្ថែម precooled 1 × PBS សម្រាប់ការលាងកោសិកា។

តារាងទី 1-1: កម្រិត PBS សម្រាប់ចំនួនកោសិកាផ្សេងៗគ្នា

ចំណាំ:ដើម្បីធានាបាននូវកោសិកាដែលជាប់ស្អិត,ការបាត់បង់កោសិកាមួយចំនួនធំត្រូវបានជៀសវាងនៅពេលលាងសម្អាត។

១.២.កោសិកាព្យួរ ឬកោសិកាដែលប្រកាន់ខ្ជាប់ ដែលត្រូវបានដាំដុះនៅក្នុងចានដែលមិនមាន porous

១.២.១.កោសិកាដែលប្រកាន់ខ្ជាប់ដែលត្រូវបានដាំដុះនៅក្នុងចានដែលមិនមានអណ្តូងច្រើន (កោសិកាព្យួរចាប់ផ្តើមពីជំហានបន្ទាប់ 1.2.2) ប្រមូល និងបំបែកកោសិកាដោយយោងតាមវិធីសាស្ត្រប្រមូលកោសិកាធម្មតា ហើយដាក់វានៅក្នុងចានវប្បធម៌ ឬបំពង់ centrifuge;ប្រសិនបើ trypsinization ត្រូវបានប្រើ តម្រូវឱ្យ centrifugation ដើម្បីប្រមូលកោសិកា និងដើម្បីយក trypsin សំណល់ចេញ បន្ថែមកោសិកាដែលផ្អាក PBS ចូលទៅក្នុងកោសិកានីមួយៗ ដើម្បីបំបែកកោសិកា។

១.២.២.បន្ទាប់​ពី​ចំនួន​ក្រឡា​ដែល​បាន​រាប់​រួច កោសិកា​ដែល​បាន​ដក​ឃ្លា 1×10⁵ មួយទៅបំពង់ centrifuge ប្រមូលកោសិកាដោយ centrifugation នៅ 1000 × g សម្រាប់ 10 នាទី។

១.២.៣.បន្ថែម 200 μl PBS ទៅបំពង់ centrifuge, កុំដាក់បំពង់ម្តងហើយម្តងទៀត, និងដោយផ្ទាល់ aspirate PBS ។បន្តទៅជំហានទី 2។ (ប្រសិនបើពិបាកក្នុងការទឹកភ្លៀង ហើយកោសិកាត្រូវបានផ្អាកម្តងទៀត អាចត្រូវបានអនុវត្ត 1000×g centrifuged 10 នាទីបន្ទាប់ពីបោះចោល supernatant គ្រាប់កោសិកាបន្តទៅជំហានទី 2)

2.Cell lysis: Remove Buffer CL សីតុណ្ហភាពរបស់វាស្មើទៅនឹងសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ DNA Eraser និង Foregene Protease Plus II យោងតាមតារាងខាងក្រោម 1-2 បានរៀបចំប្រព័ន្ធលីហ្សីសៈ (ដំណោះស្រាយ Lysis រួចរាល់សម្រាប់ការប្រើប្រាស់)។

តារាង 1-2: ការបំបែក ការរៀបចំប្រព័ន្ធ (ចំណាំ៖ នៅក្នុងការរៀបចំនៅលើទឹកកក)

3.( 24 –well plate ជាឧទាហរណ៍ ) Pipette 200 μl នៃ cell lysis master mix ចូលទៅក្នុងអណ្តូងនីមួយៗ ផ្លុំម្តងហើយម្តងទៀត 5-10 ដង ញាស់នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ (20-25 ℃) រយៈពេល 5 នាទី។

ចំណាំ:ដើម្បីជៀសវាងការបង្កើតពពុះ សូមនៅពេលដែលខ្នាត pipetting pipette ត្រូវបានកែសម្រួលទៅ 200μl ឬតិចជាងនេះ។កោសិកាអាចលេចឡើងពពកបន្ទាប់ពី lysis ដែលជារឿងធម្មតា។

4.(24 –well plate ជាឧទាហរណ៍) ត្រូវបានបន្ថែមក្នុងអង្គធាតុរាវ 20 μl Buffer ST (ប្រព័ន្ធ lysis ផ្សេងគ្នា Buffer ST បន្ថែមក្នុងបរិមាណដែលបង្ហាញក្នុងតារាងទី 1-3) បំពង់បង្ហូរម្តងទៀត 5-10 ដងនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ (20-25 ℃) ត្រូវបាន incubated រយៈពេល 2 នាទី។

ចំណាំ:ចុង pipette បោះចោលនៅខាងក្រោមផ្ទៃដោយធានាថា lysate ត្រូវបានបន្ថែម,ដើម្បីជៀសវាងការបង្កើតពពុះ សូមនៅពេលដែលខ្នាត pipetting pipette ត្រូវបានលៃតម្រូវទៅ 200μl ឬតិចជាងនេះ។

តារាង 1-3:បន្ថែម Buffer ST

5.The lysate ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការពិសោធន៍ RT-qPCR ជាបន្តបន្ទាប់។ប្រសិនបើការពិសោធន៍ជាបន្តបន្ទាប់មិនអាចត្រូវបានអនុវត្តទាន់ពេលទេ សូមទុកវានៅលើទឹកកកមិនលើសពី 2 ម៉ោង ហើយទុកនៅសីតុណ្ហភាព -20 ℃ ឬ -80 ℃ (មិនលើសពីបីខែ)។

ខ: ការរៀបចំប្រព័ន្ធ RT

1. យក 5 × Direct RT Mix ចេញ ហើយដាក់វានៅលើអាងងូតទឹកទឹកកក ទុកឱ្យវារលាយតាមធម្មជាតិ ហើយលាយវាថ្នមៗសម្រាប់ការប្រើប្រាស់នៅពេលក្រោយ។យក RNase-Free ddH2O ចេញ ហើយ​រលាយ​វា​ហើយ​ដាក់​លើ​ទឹក​កក​សម្រាប់​ប្រើ​ពេល​ក្រោយ។រៀបចំប្រព័ន្ធប្រតិកម្មលើទឹកកកយោងតាមតារាង 2-1 ខាងក្រោម។

តារាង 2-1: ការរៀបចំប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម RT

2.After បានបញ្ចប់នៃការបង្កើតប្រព័ន្ធ, លាយថ្នមៗនិង centrifuged យ៉ាងខ្លីនៅក្នុងតារាងខាងក្រោម 2 -2 លក្ខខណ្ឌប្រតិកម្មប្រតិកម្ម RT ។

តារាង 2-2: ការកំណត់លក្ខខណ្ឌប្រតិកម្ម RT

3.បន្ទាប់ពីការបញ្ចប់នៃប្រតិកម្ម ផលិតផលប្រតិកម្មត្រូវបានដាក់ដោយផ្ទាល់នៅលើទឹកកកសម្រាប់ qPCR សូមដាក់ការរក្សាទុករយៈពេលវែង -20 ℃ ឬ -80 ℃។

ចំណាំ៖ ដោយសារការប្រើប្រាស់គំរូដែលមិនបន្សុត ទឹកភ្លៀងពណ៌សអាចលេចឡើងនៅក្នុងផលិតផលចម្លងបញ្ច្រាស។នេះគឺជាបាតុភូតធម្មតា។រំកិលមជ្ឈដ្ឋានកំពូលភ្លាមៗសម្រាប់ការពិសោធន៍ជាបន្តបន្ទាប់។

ដំណោះស្រាយប្រតិកម្ម RT លទ្ធផលត្រូវបានបន្ថែមទៅប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម PCR ដំណាក់កាលបន្ទាប់ វាត្រូវបានណែនាំអោយបន្ថែមបរិមាណចាប់ពី 10-30% នៃប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម។

C: ការរៀបចំប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម qPCR

1. បរិមាណសមស្របនៃ B ដែលត្រូវបានរៀបចំក្នុងគំរូ cDNA ជំហានដោយយោងតាមតារាង 3-1 ខាងក្រោម ដើម្បីរៀបចំប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម។

ចំណាំ៖ បរិមាណនៃគំរូ cDNA មានចំនួន 10-30% នៃប្រព័ន្ធ qPCR ។ឧទាហរណ៍នៅក្នុងប្រព័ន្ធ 20μl qPCR បន្ថែម 2-6 μlនៃសតិបណ្ដោះអាសន្ន lysis ប៉ុន្តែមិនលើសពី 6 μl។

2.ការបង្កើនប្រសិទ្ធភាពលក្ខខណ្ឌ qPCR ល្អ (សីតុណ្ហភាព Annealing ។

ចំណាំ៖ ព្យាយាមប្រើលក្ខខណ្ឌដែលប្រសើរឡើងសម្រាប់ប្រតិកម្ម qPCR ដើម្បីទទួលបានលទ្ធផលប្រសើរជាងមុន។

តារាង 3-1: ការរៀបចំប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម PCR

1*: កំហាប់បឋមអាចត្រូវបានកែតម្រូវក្នុងចន្លោះពី 50-900 nM នៅពេលដែលដំណើរការប្រតិកម្ម primer ខ្សោយ។

ចំណាំ៖ ប្រព័ន្ធ qPCR អាច​ត្រូវ​បាន​កែ​តម្រូវ​តាម​តម្រូវ​ការ​ការ​ពិសោធ​ និង​គំរូ​ fluorescence cycler។សម្រាប់ qPCR ក្នុង 50μl ប្រព័ន្ធ, លៃតម្រូវកម្រិតថ្នាំ reagent តាមសមាមាត្រយោងទៅតាម 20μលីត្រ ប្រព័ន្ធ។

2*: ជ្រើសរើសកំហាប់ចុងក្រោយដែលសមស្របនៃ ROX Reference Dye ដោយយោងទៅតាម fluorescence quantitative thermal cycler ។ការប្រមូលផ្តុំ ROX Reference Dye ដែលសមស្របបំផុតសម្រាប់អ្នកជិះកង់បរិមាណ fluorescence ទូទៅត្រូវបានបង្ហាញក្នុងតារាងខាងក្រោម៖

តារាងទី 3-2៖ លក្ខខណ្ឌប្រតិកម្ម qPCR ត្រូវបានផ្តល់ជូន

ចំណាំ៖ ដើម្បីទទួលបានបែបផែន qPCR ល្អបំផុត PCR ជម្រាលអាចត្រូវបានប្រើដើម្បីបង្កើនប្រសិទ្ធភាពលក្ខខណ្ឌប្រតិកម្មសម្រាប់គំរូផ្សេងគ្នា និង primers ផ្សេងគ្នា។លក្ខខណ្ឌប្រតិកម្ម PCR ប្រែប្រួលអាស្រ័យលើឧបករណ៍វិភាគ fluorescence, template, primer ជាដើម។ ក្នុងប្រតិបត្តិការជាក់លាក់ លក្ខខណ្ឌប្រតិកម្មដ៏ល្អប្រសើរត្រូវការរចនាតាមលក្ខខណ្ឌជាក់លាក់នៃ fluorescence thermal cycler ប្រភេទគំរូ ទំហំនៃបំណែកចំណាប់អារម្មណ៍ លំដាប់មូលដ្ឋាននៃបំណែក amplified និង GC មាតិកា និងរយៈពេលនៃប្រតិកម្ម រួមទាំងពេលវេលានៃប្រតិកម្ម។ល។

គោលការណ៍នៃការរចនាបឋម PCR ពេលវេលាពិត

Primer ទៅមុខ និង បញ្ច្រាស primer

សម្រាប់ PCR ពេលវេលាពិត ការរចនាបឋមមានសារៈសំខាន់ណាស់។Primers ត្រូវបានទាក់ទងទៅនឹងភាពជាក់លាក់ និងប្រសិទ្ធភាពនៃការពង្រីក PCR ហើយអាចត្រូវបានរចនាដោយយោងទៅលើគោលការណ៍ដូចខាងក្រោមៈ

◆ប្រវែង primer: 18-30bp ។

◆មាតិកា GC: 40-60% ។

◆ តម្លៃ Tm៖ កម្មវិធីរចនាបឋម ដូចជា Primer 5 អាចផ្តល់តម្លៃ Tm នៃ primer ។តម្លៃ Tm នៃ primers ខាងលើ និងខាងក្រោមគួរតែនៅជិតបំផុតតាមដែលអាចធ្វើទៅបាន។រូបមន្តគណនា Tm ក៏អាចប្រើបានដែរ៖ Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T) ។នៅពេលអនុវត្ត PCR សីតុណ្ហភាពក្រោមតម្លៃ primer Tm នៃ 5 ° C ជាទូទៅត្រូវបានជ្រើសរើសជាសីតុណ្ហភាព annealing (ការកើនឡើងដែលត្រូវគ្នានៃសីតុណ្ហភាព annealing អាចបង្កើនភាពជាក់លាក់នៃប្រតិកម្ម PCR) ។

◆ Primers និងផលិតផល PCR:

◆ ប្រវែងផលិតផលពង្រីក PCR primer គឺល្អជាង 100-150bp ។

◆ ការរចនា primers នៅក្នុងតំបន់រចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំនៃគំរូគួរតែត្រូវបានជៀសវាងឱ្យបានច្រើនតាមដែលអាចធ្វើទៅបាន។

◆ ជៀសវាងការបង្កើតមូលដ្ឋានបំពេញបន្ថែម 2 ឬច្រើនរវាងចុង 3′ នៃបឋមទឹកឡើង និងខាងក្រោម។

◆ មូលដ្ឋានស្ថានីយ Primer 3′ មិនអាចមានវត្តមានជាមួយ G ឬ C ជាប់គ្នា 3 បន្ថែមទេ។

◆ សារធាតុ primers ខ្លួនឯងមិនអាចមានរចនាសម្ព័ន្ធបំពេញបន្ថែមទេ បើមិនដូច្នេះទេ រចនាសម្ព័ន្ធរបស់ hairpin នឹងត្រូវបានបង្កើតឡើង ដែលប៉ះពាល់ដល់ PCR amplification ។

◆ ATCG គួរតែត្រូវបានចែកចាយស្មើៗគ្នាតាមដែលអាចធ្វើបាននៅក្នុងលំដាប់បឋម ហើយមូលដ្ឋានស្ថានីយ 3′ គួរតែត្រូវបានជៀសវាងដូចជា T.

ឧបសម្ព័ន្ធ1:Cដោយផ្ទាល់RT-qPCR សំណុំសមាសធាតុt កញ្ចប់បន្ថែម

1.Cell Lysis Solution