វាត្រូវបានគេស្គាល់យ៉ាងច្បាស់ថានៅក្នុង dogma កណ្តាល RNA គឺជាអ្នកសម្រុះសម្រួលចម្លងរវាង DNA និងការបញ្ចេញប្រូតេអ៊ីន។បើប្រៀបធៀបជាមួយនឹងការរកឃើញ DNA ការរកឃើញ RNA អាចឆ្លុះបញ្ចាំងយ៉ាងច្បាស់អំពីការបញ្ចេញហ្សែននៅក្នុងសារពាង្គកាយ។ការពិសោធន៍ដែលពាក់ព័ន្ធនឹង RNA រួមមានៈ qRT-PCR, RNA-Seq និងការរកឃើញហ្សែនរួមបញ្ចូលគ្នា។សំរាមចូល សំរាមចេញ ប្រសិនបើគុណភាពនៃ RNA មិនល្អ នោះលទ្ធផលពិសោធន៍ត្រូវតែមិនពេញចិត្ត ជាពិសេសត្រូវបានបង្ហាញថាជាទិន្នន័យមិនត្រឹមត្រូវ ឬអាចធ្វើឡើងវិញបានខ្សោយ។ដូច្នេះការយកចិត្តទុកដាក់បន្ថែមទៀតគួរតែត្រូវបានបង់ទៅដំណើរការនៃ RNA ហើយតំណភ្ជាប់នៃការត្រួតពិនិត្យគុណភាពក៏មានសារៈសំខាន់ផងដែរដើម្បីធានាបាននូវភាពជាក់លាក់និងភាពត្រឹមត្រូវនៃទិន្នន័យពិសោធន៍ជាបន្តបន្ទាប់។

សម្រាប់ការត្រួតពិនិត្យគុណភាពនៃ RNA ជាទូទៅមានវិធីសាស្រ្តដែលប្រើជាទូទៅដូចខាងក្រោម:

• ទស្សនវិជ្ជា
• agarose gel electrophoresis
• Agilent Bioanalyzer
• PCR បរិមាណ fluorescent ពេលវេលាពិត
• វិធីសាស្រ្តនៃការជ្រលក់ពណ៌ fluorescent

01 Spectrophotometric

RNA បានបង្រួបបង្រួមចំណងទ្វេរដង និងមានកំពូលនៃការស្រូបទាញនៅរលកប្រវែង 260nm ។យោងតាមច្បាប់របស់ Lambert-Beer យើងអាចគណនាកំហាប់ RNA ពីកំពូលនៃការស្រូបយកនៅ 260nm ។លើសពីនេះទៀតយើងក៏អាចគណនាភាពបរិសុទ្ធនៃ RNA យោងតាមសមាមាត្រនៃ 260nm, 280nm និង 230nm កំពូលស្រូបយក។280nm និង 230nm គឺជាកំពូលនៃការស្រូបយកប្រូតេអ៊ីន និងម៉ូលេគុលតូចៗរៀងៗខ្លួន។សមាមាត្រនៃ A260/A280 និង A260/A230 នៃភាពបរិសុទ្ធ RNA ដែលមានលក្ខណៈសម្បត្តិគ្រប់គ្រាន់គួរតែធំជាង 2។ ប្រសិនបើវាតិចជាង 2 វាមានន័យថាមានការចម្លងរោគប្រូតេអ៊ីន ឬម៉ូលេគុលតូចនៅក្នុងគំរូ RNA ហើយចាំបាច់ត្រូវបន្សុតម្តងទៀត។ប្រភពនៃការចម្លងរោគនឹងប៉ះពាល់ដល់ការពិសោធន៍ខាងក្រោម ដូចជាការរារាំងប្រសិទ្ធភាពពង្រីកនៃប្រតិកម្ម PCR ដែលបណ្តាលឱ្យមានលទ្ធផលបរិមាណមិនត្រឹមត្រូវ។ភាពបរិសុទ្ធនៃ RNA មានឥទ្ធិពលយ៉ាងខ្លាំងទៅលើលទ្ធផលជាបន្តបន្ទាប់ ដូច្នេះ spectrophotometry ជាទូទៅគឺជាតំណភ្ជាប់ត្រួតពិនិត្យគុណភាពដែលមិនអាចខ្វះបាននៅក្នុងជំហានដំបូងក្នុងការពិសោធន៍អាស៊ីត nucleic ។

រូបភាពទី 1. វិសាលគមស្រូប RNA/DNA ធម្មតា

02 Agarose gel electrophoresis

បន្ថែមពីលើភាពបរិសុទ្ធ ភាពសុចរិតនៃ RNA ក៏ជាសូចនាករសំខាន់មួយសម្រាប់វិនិច្ឆ័យគុណភាពនៃ RNA ផងដែរ។ការរិចរិលនៃ RNA នឹងនាំឱ្យមានចំនួនដ៏ច្រើននៃបំណែកខ្លីៗនៅក្នុងគំរូ ដូច្នេះចំនួននៃបំណែក RNA ដែលអាចត្រូវបានរកឃើញយ៉ាងមានប្រសិទ្ធភាព និងគ្របដណ្តប់ដោយលំដាប់យោងនឹងត្រូវបានកាត់បន្ថយ។ភាពត្រឹមត្រូវនៃ RNA អាចត្រូវបានត្រួតពិនិត្យដោយ electrophoresis នៃ RNA សរុបនៅលើជែល agarose 1% ។វិធីសាស្រ្តនេះអាចកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធជែលដោយខ្លួនឯង ឬប្រើប្រព័ន្ធ E-Gel™ ដែលរៀបចំរួចសម្រាប់ការធ្វើតេស្តភាពសុចរិត។ច្រើនជាង 80% នៃ RNA សរុបគឺ ribosomal RNA ដែលភាគច្រើនត្រូវបានផ្សំឡើងដោយ 28S និង 18S rRNA (នៅក្នុងប្រព័ន្ធថនិកសត្វ)។RNA ដែលមានគុណភាពល្អនឹងបង្ហាញរបារភ្លឺច្បាស់ពីរដែលជារបារភ្លឺ 28S និង 18S រៀងគ្នានៅ 5 Kb និង 2 Kb ហើយសមាមាត្រនឹងមានទំនោរទៅជិត 2: 1 ។ប្រសិនបើវាស្ថិតនៅក្នុងស្ថានភាពសាយភាយ វាមានន័យថាសំណាក RNA ប្រហែលជាត្រូវបានបង្ខូច ហើយវាត្រូវបានណែនាំឱ្យប្រើវិធីសាស្ត្រដែលបានពិពណ៌នានៅពេលក្រោយ ដើម្បីធ្វើតេស្តគុណភាពនៃ RNA បន្ថែមទៀត។

រូបភាពទី 2. ការប្រៀបធៀបនៃការរិចរិល (ផ្លូវទី 2) និង RNA ដដែល (ផ្លូវទី 3) នៅលើ agarose gel electrophoresis

០៣ ឧបករណ៍វិភាគជីវគីមី

បន្ថែមពីលើវិធីសាស្រ្ត electrophoresis ជែល agarose ដែលបានពិពណ៌នាខាងលើ ដែលអាចជួយយើងកំណត់អត្តសញ្ញាណភាពសុចរិតនៃ RNA យ៉ាងសាមញ្ញ និងឆាប់រហ័ស យើងក៏អាចប្រើ Agilent bioanalyzer ដើម្បីកំណត់ភាពសុចរិតនៃ RNA ផងដែរ។វាប្រើការរួមបញ្ចូលគ្នានៃ microfluidics, capillary electrophoresis និង fluorescence ដើម្បីវាយតម្លៃកំហាប់ RNA និងភាពសុចរិត។ដោយប្រើក្បួនដោះស្រាយដែលភ្ជាប់មកជាមួយដើម្បីវិភាគទម្រង់នៃគំរូ RNA អ្នកវិភាគជីវសាស្ត្រ Agilent អាចគណនាតម្លៃយោង RNA Integrity Number, RNA Integrity Number (តទៅនេះហៅថា RIN) [1] ។តម្លៃរបស់ RIN កាន់តែធំ ភាពសុចរិតរបស់ RNA កាន់តែខ្ពស់ (1 ត្រូវបានរិចរិលយ៉ាងខ្លាំង 10 គឺពេញលេញបំផុត) ។ការពិសោធន៍មួយចំនួនដែលពាក់ព័ន្ធនឹង RNA ស្នើឱ្យប្រើ RIN ជាប៉ារ៉ាម៉ែត្រសម្រាប់ការវាយតម្លៃគុណភាព។ទទួលយកការពិសោធន៍តាមលំដាប់លំដោយខ្ពស់ (ដែលក្រោយមកហៅថា NGS) ជាឧទាហរណ៍ គោលការណ៍ណែនាំនៃ Oncomine™ Human Immune Repertoire ដែលត្រូវបានប្រើដើម្បីរកឱ្យឃើញអង់ទីហ្សែនកោសិកា B និង T cell នៅក្នុងស៊េរីបន្ទះ Thermo Fisher's Oncomine ណែនាំថាសំណាកដែលមានតម្លៃ RIN ធំជាង 4 ការវាស់វែងកាន់តែមានប្រសិទ្ធភាពជាងនេះ) (Fines អាចអានបានច្រើន) ។មានជួរដែលបានណែនាំផ្សេងៗគ្នាសម្រាប់បន្ទះផ្សេងៗគ្នា ហើយជារឿយៗ RIN ខ្ពស់អាចនាំមកនូវទិន្នន័យកាន់តែមានប្រសិទ្ធភាព។

រូបភាពទី 3 នៅក្នុងការពិសោធន៍ Oncomine™ Human Immune Repertoire គំរូដែលមាន RIN ធំជាង 4 អាចរកឃើញការអាន និង T cell clones ដែលមានប្រសិទ្ធភាពជាង។【2】

ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយតម្លៃ RIN ក៏មានដែនកំណត់មួយចំនួនផងដែរ។ទោះបីជា RIN មានទំនាក់ទំនងខ្ពស់ជាមួយនឹងគុណភាពនៃទិន្នន័យពិសោធន៍ NGS ក៏ដោយ ក៏វាមិនសមរម្យសម្រាប់គំរូ FFPE ដែរ។សំណាក FFPE ត្រូវ​បាន​គេ​ព្យាបាល​ដោយ​គីមី​ជា​យូរ​មក​ហើយ ហើយ RNA ដែល​បាន​ដក​ចេញ​ជា​ទូទៅ​មាន​តម្លៃ RIN ទាប។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយនេះមិនមានន័យថាទិន្នន័យដែលមានប្រសិទ្ធភាពនៃការពិសោធន៍ត្រូវតែមិនពេញចិត្តនោះទេ។ដើម្បីវាយតម្លៃគុណភាពនៃសំណាក FFPE យ៉ាងត្រឹមត្រូវ យើងត្រូវប្រើការវាស់វែងក្រៅពី RIN ។បន្ថែមពីលើ RIN, Agilent bioanalyzer ក៏អាចគណនាតម្លៃ DV200 ជាប៉ារ៉ាម៉ែត្រវាយតម្លៃនៃគុណភាព RNA ផងដែរ។DV200 គឺជាប៉ារ៉ាម៉ែត្រដែលគណនាសមាមាត្រនៃបំណែកធំជាង 200 bp នៅក្នុងគំរូ RNA ។DV200 គឺជាសូចនាករដ៏ល្អនៃគុណភាពគំរូ FFPE ជាង RIN ។ចំពោះ RNA ដែលស្រង់ចេញដោយ FFPE វាមានទំនាក់ទំនងខ្ពស់ជាមួយនឹងចំនួនហ្សែនដែលអាចត្រូវបានរកឃើញយ៉ាងមានប្រសិទ្ធភាព និងភាពចម្រុះនៃហ្សែន [3] ។ទោះបីជា DV200 អាចបង្កើតភាពខ្វះខាតក្នុងការរកឃើញគុណភាពនៃ FFPE ក៏ដោយ ក៏ឧបករណ៍វិភាគជីវសាស្ត្រ Agilent នៅតែមិនអាចវិភាគយ៉ាងទូលំទូលាយអំពីបញ្ហាគុណភាពនៅក្នុងសំណាក RNA រួមទាំងថាតើមានសារធាតុរារាំងនៅក្នុងសំណាក។អ្នករារាំងខ្លួនឯងអាចប៉ះពាល់ដល់ប្រសិទ្ធភាពពង្រីកនៃការពិសោធន៍ខាងក្រោម និងកាត់បន្ថយបរិមាណទិន្នន័យមានប្រយោជន៍។ដើម្បី​ដឹង​ថា​តើ​មាន​សារធាតុ​រារាំង​ក្នុង​គំរូ​ឬ​អត់ យើង​អាច​ប្រើ​វិធីសាស្ត្រ PCR បរិមាណ fluorescent ក្នុង​ពេល​ជាក់ស្តែង​ដែល​បាន​ពិពណ៌នា​បន្ទាប់។

04 PCR បរិមាណ fluorescent ពេលវេលាពិត

វិធីសាស្ត្រ PCR បរិមាណ fluorescent ក្នុងពេលជាក់ស្តែងមិនត្រឹមតែអាចរកឃើញសារធាតុ inhibitors នៅក្នុងគំរូប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែថែមទាំងឆ្លុះបញ្ចាំងយ៉ាងត្រឹមត្រូវនូវគុណភាពនៃ RNA នៅក្នុងគំរូ FFPE ផងដែរ។បើប្រៀបធៀបជាមួយឧបករណ៍វិភាគជីវសាស្ត្រ Agilent ឧបករណ៍បរិមាណហ្វ្លុយអូរីសក្នុងពេលជាក់ស្តែងគឺមានប្រជាប្រិយភាពជាងនៅក្នុងមន្ទីរពិសោធន៍ជីវសាស្ត្រសំខាន់ៗ ដោយសារការប្រើប្រាស់កាន់តែទូលំទូលាយ។ដើម្បីសាកល្បងគុណភាពនៃសំណាក RNA យើងគ្រាន់តែត្រូវការទិញ ឬរៀបចំការស៊ើបអង្កេតបឋមសម្រាប់ហ្សែនយោងខាងក្នុង ដូចជា GUSB (Cat no. Hs00939627) ជាដើម។ដោយប្រើសំណុំនៃ primers ការស៊ើបអង្កេត និងស្តង់ដារនេះ (RNA សរុបនៃកំហាប់ដែលគេស្គាល់) ដើម្បីធ្វើការពិសោធន៍បរិមាណដាច់ខាត ការប្រមូលផ្តុំបំណែក RNA ដែលមានប្រសិទ្ធភាពអាចត្រូវបានគណនាជាស្តង់ដារវាយតម្លៃគុណភាព RNA (Functional RNA Quantitation (FRQ) សម្រាប់រយៈពេលខ្លី)។នៅក្នុងការធ្វើតេស្ត NGS យើងបានរកឃើញថា FRQ នៃគំរូ RNA មានទំនាក់ទំនងខ្ពស់ជាមួយនឹងបរិមាណទិន្នន័យដែលមានប្រសិទ្ធភាព។សម្រាប់គំរូទាំងអស់ដែលធំជាង 0.2ng/uL FRQ យ៉ាងហោចណាស់ 70% នៃការអានអាចគ្របដណ្តប់យ៉ាងមានប្រសិទ្ធភាពនូវលំដាប់យោង (រូបភាពទី 4)។

រូបភាពទី 4 តម្លៃ FRQ ដែលបានរកឃើញដោយវិធីសាស្រ្តបរិមាណហ្វ្លុយអូរីសមានទំនាក់ទំនងខ្ពស់ណាស់ (R2> 0.9) ជាមួយនឹងទិន្នន័យដែលមានប្រសិទ្ធភាពដែលទទួលបាននៅក្នុងការពិសោធន៍ NGS ។បន្ទាត់ក្រហមគឺជាតម្លៃ FRQ ស្មើនឹង 0.2 ng/uL (log10 = -0.7) ។【4】

បន្ថែមពីលើការអាចអនុវត្តបានចំពោះសំណាក FFPE វិធីសាស្ត្រ PCR បរិមាណពេលវេលាពិតក៏អាចតាមដានយ៉ាងមានប្រសិទ្ធភាពចំពោះថ្នាំទប់ស្កាត់នៅក្នុងគំរូផងដែរ។យើងអាចបន្ថែមសំណាកដែលត្រូវបានរកឃើញទៅក្នុងប្រព័ន្ធប្រតិកម្មជាមួយនឹងការគ្រប់គ្រងវិជ្ជមានផ្ទៃក្នុង (IPC) និងការវិភាគរបស់វា ហើយបន្ទាប់មកអនុវត្តបរិមាណ fluorescence ដើម្បីទទួលបានតម្លៃ Ct ។ប្រសិនបើតម្លៃ Ct យឺតជាងតម្លៃ Ct ក្នុងប្រតិកម្មគ្មានគំរូ វាបង្ហាញថា inhibitor មាននៅក្នុងគំរូ និងរារាំងប្រសិទ្ធភាព amplification ក្នុងប្រតិកម្ម។

05 វិធីសាស្រ្តនៃការជ្រលក់ពណ៌ fluorescent

Qubit Fluorometer គឺជាឧបករណ៍តូចមួយដែលប្រើជាទូទៅបំផុតសម្រាប់ការប្រមូលផ្តុំអាស៊ីត nucleic និងការរកឃើញភាពបរិសុទ្ធ ដែលងាយស្រួលដំណើរការ និងមាននៅក្នុងស្ទើរតែគ្រប់បន្ទប់ពិសោធន៍ជីវវិទ្យាម៉ូលេគុលទាំងអស់។វាគណនាយ៉ាងត្រឹមត្រូវនូវកំហាប់នៃអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីកដោយការរកឃើញ និងការជ្រលក់ពណ៌ fluorescent ដែលភ្ជាប់អាស៊ីត nucleic (Qubit detection reagent)។Qubit មានភាពរសើប និងជាក់លាក់ខ្ពស់ ហើយអាចកំណត់បរិមាណ RNA យ៉ាងត្រឹមត្រូវចុះដល់កំហាប់ pg/µL។បន្ថែមពីលើសមត្ថភាពដ៏ល្បីក្នុងការកំណត់បរិមាណកំហាប់អាស៊ីត nucleic យ៉ាងត្រឹមត្រូវ ម៉ូដែលថ្មីចុងក្រោយបំផុតរបស់ Thermo Fisher គឺ Qubit 4.0 ក៏អាចរកឃើញភាពសុចរិតនៃ RNA ផងដែរ។ប្រព័ន្ធរកឃើញ RNA របស់ Qubit 4.0's (RNA IQ Assay) រកឃើញភាពសុចរិតនៃ RNA ដោយរកឃើញពណ៌ fluorescent ជាក់លាក់ពីរក្នុងពេលដំណាលគ្នា។ថ្នាំលាប fluorescent ទាំងពីរនេះអាចភ្ជាប់ទៅនឹងបំណែកធំ និងបំណែកតូចៗនៃ RNA រៀងគ្នា។ថ្នាំលាប fluorescent ទាំងពីរនេះបង្ហាញពីសមាមាត្រនៃបំណែកដ៏ធំនៃ RNA នៅក្នុងគំរូ ហើយពីនេះតម្លៃ IQ (Integrity and Quality) ដែលតំណាងឱ្យគុណភាព RNA អាចត្រូវបានគណនា។តម្លៃ IQ អាចអនុវត្តបានចំពោះទាំងគំរូ FFPE និងមិនមែន FFPE ហើយមានឥទ្ធិពលយ៉ាងខ្លាំងទៅលើគុណភាពនៃលំដាប់ជាបន្តបន្ទាប់។យកការពិសោធន៍ NGS ជាឧទាហរណ៍ នៅក្នុងការពិសោធន៍សាកល្បង RNA-Seq ដែលធ្វើឡើងនៅលើវេទិកា Ion torrent™ គំរូភាគច្រើនដែលមានតម្លៃ IQ លើសពី 4 មានអានុភាពយ៉ាងតិច 50% (រូបភាពទី 5)។បើប្រៀបធៀបជាមួយនឹងវិធីសាស្ត្ររាវរកដែលបានរៀបរាប់ខាងលើ Qubit IQ Assay មិនត្រឹមតែមានភាពងាយស្រួលក្នុងប្រតិបត្តិការ និងចំណាយពេលតិចជាងមុន (ក្នុងរយៈពេលប្រាំនាទី) ប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែក៏មានទំនាក់ទំនងយ៉ាងខ្លាំងរវាងប៉ារ៉ាម៉ែត្រវាស់តម្លៃ IQ និងគុណភាពទិន្នន័យនៃការពិសោធន៍ខាងក្រោមផងដែរ។

រូបភាពទី 5 មានការជាប់ទាក់ទងគ្នាដ៏អស្ចារ្យរវាងតម្លៃ Qubit RNA IQ និងការអានដែលបានគូសផែនទីនៃ RNA-Seq ។【5】

តាមរយៈការណែនាំខាងលើ ខ្ញុំជឿថាអ្នកគ្រប់គ្នាមានការយល់ដឹងគ្រប់គ្រាន់អំពីវិធីសាស្ត្រត្រួតពិនិត្យគុណភាព RNA ផ្សេងៗគ្នា។នៅក្នុងការអនុវត្តអ្នកអាចជ្រើសរើសវិធីសាស្រ្តដែលត្រូវគ្នាតាមប្រភេទគំរូ និងឧបករណ៍ដែលមានស្រាប់។មានតែការគ្រប់គ្រងគុណភាពនៃ RNA ឱ្យបានល្អប៉ុណ្ណោះដែលយើងអាចជៀសវាងការបរាជ័យនៃការពិសោធន៍ជាបន្តបន្ទាប់ដែលបណ្តាលមកពីគុណភាពគំរូមិនល្អ ដូច្នេះការសន្សំពេលវេលា ថាមពល និងការចំណាយដ៏មានតម្លៃ។

ផលិតផលយោង៖

ឧបករណ៍ញែក RNA សរុបរបស់សត្វ

សំណុំកោសិកាដាច់ពីគ្នា RNA សរុប

ឯកសារយោង

【1】 Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN: លេខសុចរិតភាព RNA សម្រាប់កំណត់តម្លៃសុចរិតភាពទៅរង្វាស់ RNA ។BMC Molecular Biol 7, 3 (2006) ។https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Oncomine Human Immune Repertoire មគ្គុទ្ទេសក៍អ្នកប្រើប្រាស់ (Pub. No. MAN0017438 Rev. C.0) ។

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, មេគុណគុណភាពដែលបានកែលម្អសម្រាប់ការវាយតម្លៃ RNA ដែលទទួលបានពី Archival Formalin-Fixed Paraffin-embedded Tissues, វិទ្យាសាស្ត្រពុល, លេខ 207 ថ្ងៃទី 30 ខែ សីហា ឆ្នាំ 2017 លេខ 207 លេខ 30 ថ្ងៃទី 31 ខែ សីហា ឆ្នាំ 2017 ៣,https://doi.org/10.1093/toxsci/