នៅក្នុងការពិសោធន៍ qPCR ការរចនាបឋមក៏ជាតំណភ្ជាប់ដ៏សំខាន់ផងដែរ។ថាតើ primers សមស្របឬអត់គឺទាក់ទងយ៉ាងជិតស្និទ្ធទៅនឹងថាតើប្រសិទ្ធភាព amplification ឈានដល់ស្តង់ដារ ថាតើផលិតផល amplified មានលក្ខណៈជាក់លាក់ និងថាតើលទ្ធផលពិសោធន៍មានដែរឬទេ។
ដូច្នេះតើធ្វើដូចម្តេចដើម្បីធ្វើឱ្យ qPCR ជាក់លាក់ primer ល្អប្រសើរជាងមុន?ប្រសិទ្ធភាពពង្រីកខ្ពស់?
ថ្ងៃនេះ យើងនឹងនាំអ្នកទៅរចនា qPCR primer ជាមួយគ្នា ហើយអនុញ្ញាតឱ្យការរចនាបឋម qPCR ក្លាយជាជំនាញដែលមានប្រសិទ្ធភាពក្នុងការពិសោធន៍។
នៅពេលរចនា qPCR primers ជាធម្មតាត្រូវយកចិត្តទុកដាក់លើចំណុចខាងក្រោម៖ primers គួរតែត្រូវបានរចនាឡើងនៅទូទាំង introns តាមដែលអាចធ្វើទៅបាន ប្រវែងផលិតផលគួរតែមានពី 100-300 bp តម្លៃ Tm គួរតែនៅជិតបំផុតតាមដែលអាចធ្វើទៅបានដល់ 60°C ហើយ primers ខាងលើ និងខាងក្រោមគួរតែនៅជិតបំផុតតាមដែលអាចធ្វើទៅបាន ហើយចុងបញ្ចប់នៃ primer គួរតែជា G ឬ C ។ល។
1. ការរចនានៃ primers លាតសន្ធឹង introns
នៅពេលរចនា qPCR primers ការជ្រើសរើស primers ដែលរចនានៅទូទាំង introns អាចការពារគំរូ gDNA ពីការពង្រីក ហើយផលិតផលទាំងអស់គឺបានមកពី amplification នៃ cDNA ដូច្នេះការលុបបំបាត់ឥទ្ធិពលនៃការចម្លងរោគ gDNA ។
2. ប្រវែងបឋម
ប្រវែង primer ជាទូទៅមានចន្លោះពី 18-30 nt ហើយប្រវែងនៃផលិតផល amplification គួរតែត្រូវបានគ្រប់គ្រងចន្លោះពី 100-300 bp តាមដែលអាចធ្វើបាន។
ប្រសិនបើ primer ខ្លីពេក វានឹងនាំទៅដល់ការពង្រីកមិនជាក់លាក់ ហើយប្រសិនបើវាវែងពេក វានឹងងាយស្រួលបង្កើតជារចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំ (ដូចជា hairpin structure)។ប្រសិនបើផលិតផល amplification វែងពេក វាមិនស័ក្តិសមសម្រាប់ប្រតិកម្មនៃសារធាតុ polymerase ដែលនឹងប៉ះពាល់ដល់ប្រសិទ្ធភាពនៃ PCR amplification ។
3. មាតិកា GC និងតម្លៃ Tm
មាតិកា GC នៃ primers គួរតែត្រូវបានគ្រប់គ្រងចន្លោះពី 40% ទៅ 60% ។ប្រសិនបើវាខ្ពស់ពេក ឬទាបពេក វាមិនអំណោយផលដល់ការចាប់ផ្តើមប្រតិកម្មនោះទេ។ខ្លឹមសារ GC នៃ primers ទៅមុខ និងបញ្ច្រាសគួរតែនៅជិតដូចគ្នា ដើម្បីទទួលបានតម្លៃ Tm ដូចគ្នា និងសីតុណ្ហភាព annealing ។
តម្លៃ Tm គួរតែស្ថិតនៅចន្លោះពី 55-65°C តាមដែលអាចធ្វើបាន ជាទូទៅប្រហែល 60°C ហើយតម្លៃ Tm នៃចរន្តទឹក និងទឹកខាងក្រោមគួរតែនៅជិតបំផុតតាមដែលអាចធ្វើទៅបាន និយមមិនលើសពី 4°C។
4. ជៀសវាងការជ្រើសរើស A នៅចុង 3′ នៃ primer
នៅពេលដែលចុង 3′ នៃ primer មិនត្រូវគ្នា វាមានភាពខុសគ្នាខ្លាំងនៅក្នុងប្រសិទ្ធភាពនៃការសំយោគនៃមូលដ្ឋានផ្សេងៗគ្នា។នៅពេលដែលមូលដ្ឋានចុងក្រោយគឺ A វាក៏អាចផ្តួចផ្តើមការសំយោគខ្សែសង្វាក់សូម្បីតែនៅក្នុងករណីនៃការមិនស៊ីគ្នា ហើយនៅពេលដែលមូលដ្ឋានចុងក្រោយគឺ T នៅពេលដែលប្រសិទ្ធភាពនៃអាំងឌុចស្យុងមិនស៊ីគ្នាត្រូវបានកាត់បន្ថយយ៉ាងខ្លាំង។ដូច្នេះ ព្យាយាម​ចៀសវាង​ការ​ជ្រើស​រើស A នៅ​ចុង 3′ នៃ primer ហើយ​យក​ល្អ​ជាង​ជ្រើសរើស T ។
ប្រសិនបើវាជា primer ស៊ើបអង្កេត ចុង 5′ នៃ probe មិនអាចជា G បានទេ ព្រោះសូម្បីតែនៅពេលដែល G តែមួយត្រូវបានភ្ជាប់ទៅក្រុម FAM fluorescent reporter G ក៏អាចពន្លត់សញ្ញា fluorescent ដែលបញ្ចេញដោយក្រុម FAM ដែលបណ្តាលឱ្យមានលទ្ធផលអវិជ្ជមានមិនពិត។លេចឡើង។
5. ការចែកចាយមូលដ្ឋាន
ការចែកចាយមូលដ្ឋានទាំងបួននៅក្នុង primer គឺចូលចិត្តចៃដន្យ ដោយជៀសវាងលើសពី 3 ជាប់គ្នា G ឬ C នៅចុងបញ្ចប់ 3′ និងច្រើនជាង 3 ជាប់គ្នា។G ឬ C ងាយស្រួលក្នុងការបង្កើតការផ្គូផ្គងនៅក្នុងតំបន់លំដាប់ដែលសំបូរទៅដោយ GC ។
6. តំបន់រចនាបឋមគួរជៀសវាងរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំដែលស្មុគស្មាញ។
រចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំដែលបង្កើតឡើងដោយខ្សែតែមួយនៃផលិតផល amplification នឹងប៉ះពាល់ដល់ដំណើរការរលូននៃ PCR ។ដោយការទស្សន៍ទាយថាតើមានរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំនៅក្នុងលំដាប់គោលដៅជាមុនឬអត់ សូមព្យាយាមជៀសវាងតំបន់នេះនៅក្នុងការរចនានៃ primers ។
7. primers ខ្លួនឯងនិងរវាង primers គួរតែព្យាយាមជៀសវាងមូលដ្ឋានដែលបំពេញបន្ថែមជាបន្តបន្ទាប់។
មិនអាចមានការបំពេញបន្ថែមមូលដ្ឋាន 4 ជាប់គ្នារវាង primer ខ្លួនវានិង primer ទេ។primer ខ្លួនវាមិនគួរមានលំដាប់បន្ថែមទេបើមិនដូច្នេះទេវានឹងបត់ខ្លួនវាដើម្បីបង្កើតរចនាសម្ព័ន្ធ hairpin ដែលនឹងប៉ះពាល់ដល់ការរួមបញ្ចូលគ្នានៃ primer និង template ។
លំដាប់​បន្ថែម​មិន​អាច​មាន​រវាង​បឋម​ទឹក​ឡើង​ទៅ​ក្រោម។ការបំពេញបន្ថែមរវាង primers នឹងបង្កើត primer dimers ដែលនឹងកាត់បន្ថយប្រសិទ្ធភាព PCR និងសូម្បីតែប៉ះពាល់ដល់ភាពត្រឹមត្រូវបរិមាណ។ប្រសិនបើរចនាសម្ព័ន្ធ primer-dimer និង hairpin មិនអាចជៀសបាននោះតម្លៃ △G មិនគួរខ្ពស់ពេកទេ (គួរតែតិចជាង 4.5 kcal/mol)។
8. ថ្នាំ primers ពង្រីកផលិតផលជាក់លាក់គោលដៅ។
គោលដៅចុងក្រោយនៃការរកឃើញ qPCR គឺដើម្បីយល់ពីភាពសម្បូរបែបនៃហ្សែនគោលដៅ។ប្រសិនបើការពង្រីកមិនជាក់លាក់កើតឡើង បរិមាណនឹងមានភាពមិនត្រឹមត្រូវ។ដូច្នេះបន្ទាប់ពី primers ត្រូវបានរចនាឡើងពួកគេត្រូវធ្វើតេស្តដោយ BLAST ហើយភាពជាក់លាក់នៃផលិតផលត្រូវបានប្រៀបធៀបនៅក្នុងមូលដ្ឋានទិន្នន័យលំដាប់។
បន្ទាប់មក យើងយកហ្សែន GAS6 (Growth capture specific 6) របស់មនុស្សជាឧទាហរណ៍ដើម្បីរចនា qPCR primers ។
01 ហ្សែនសំណួរ
Homo GAS ៦តាមរយៈ NCBI ។នៅទីនេះ យើងគួរតែយកចិត្តទុកដាក់លើការប្រៀបធៀបឈ្មោះហ្សែន និងប្រភេទសត្វ ដើម្បីធានាថាវាមានភាពស៊ីសង្វាក់គ្នា។
02 ស្វែងរកលំដាប់ហ្សែន
(1) ប្រសិនបើ​លំដាប់​គោលដៅ​គឺ DNA ហ្សែន សូម​ជ្រើសរើស​លេខ​ទីមួយ​ដែលជា​លំដាប់ DNA ហ្សែន​របស់​ហ្សែន។
(2) ប្រសិនបើលំដាប់គោលដៅគឺ mRNA សូមជ្រើសរើសទីពីរ។បន្ទាប់ពីបញ្ចូលសូមចុច "CDS" នៅក្នុងតារាងខាងក្រោម។លំដាប់ផ្ទៃខាងក្រោយពណ៌ត្នោតគឺជាលំដាប់កូដនៃហ្សែន។
03 ការរចនាបឋម
បញ្ចូលចំណុចប្រទាក់ Primer-BLAST
បញ្ចូលលេខលំដាប់ហ្សែន ឬលំដាប់ក្នុងទម្រង់ Fasta នៅផ្នែកខាងលើខាងឆ្វេង ហើយបំពេញប៉ារ៉ាម៉ែត្រដែលពាក់ព័ន្ធ។

ចុច "Get primers" ហើយ NCBI នឹងលេចឡើងដើម្បីប្រាប់អ្នកថាការជ្រើសរើសប៉ារ៉ាម៉ែត្របែបនេះនឹងត្រូវបានពង្រីកទៅវ៉ារ្យ៉ង់នៃការភ្ជាប់ផ្សេងទៀត។យើង​អាច​ពិនិត្យ​មើល​វ៉ារ្យ៉ង់​នៃ​ការ​បំបែក​ផ្សេង​គ្នា ហើយ​ដាក់​បញ្ជូន​វា​ដើម្បី​ទទួល​បាន​គូ primer ដែល​សមរម្យ (ដូច​បង្ហាញ​ក្នុង​រូប​ខាងក្រោម)។ដំណើរការនេះអាចចំណាយពេលរាប់សិបវិនាទីដើម្បីដំណើរការ។
សីតុណ្ហភាពនៃការស្រោបនៃគូ primer ទាំងនេះគឺនៅជុំវិញ 60 ° C ។យោងតាមគោលបំណងនៃការពិសោធន៍ សូមជ្រើសរើសថ្នាំ primers ដែលមានប្រវែងមធ្យម ជាក់លាក់ល្អ និងមិនសូវបំពេញបន្ថែមដោយខ្លួនឯងនៃ primers សម្រាប់ការពិសោធន៍ ហើយអត្រាជោគជ័យគឺខ្ពស់ណាស់!
04 ការផ្ទៀងផ្ទាត់ភាពជាក់លាក់បឋម
ជាការពិត បន្ថែមពីលើការរចនា primers Primer-Blast ក៏អាចវាយតម្លៃ primers ដែលយើងរចនាដោយខ្លួនឯងបានផងដែរ។ត្រឡប់ទៅទំព័ររចនាបឋម បញ្ចូលបឋមកថាខាងលើ និងខាងក្រោមដែលយើងបានរចនា ហើយប៉ារ៉ាម៉ែត្រផ្សេងទៀតនឹងមិនត្រូវបានកែតម្រូវទេ។បន្ទាប់​ពី​បាន​ដាក់​ស្នើ អ្នក​អាច​មើល​ថា​តើ​ primers ទាំង​ពីរ​ក៏​មាន​នៅ​លើ​ហ្សែន​ផ្សេង​ទៀត​ដែរ។ប្រសិនបើពួកវាទាំងអស់ត្រូវបានបង្ហាញនៅលើហ្សែនដែលយើងចង់ពង្រីក នោះបង្ហាញថាភាពជាក់លាក់នៃ primers មួយគូនេះគឺអស្ចារ្យណាស់!(ឧទាហរណ៍ នេះជាលទ្ធផលតែមួយគត់នៃសំណួរបឋម!)

05 ការវិនិច្ឆ័យគុណភាពបឋម
តើ primer ប្រភេទណាដែល "ល្អឥតខ្ចោះ" ដែលរួមបញ្ចូលគ្នានូវ "ប្រសិទ្ធភាពពង្រីករហូតដល់ស្តង់ដារ" "លក្ខណៈផលិតផលពង្រីក" និង "លទ្ធផលពិសោធន៍ដែលអាចទុកចិត្តបាន"?
ប្រសិទ្ធភាពពង្រីក

ខ្សែកោងរលាយ
ប្រសិទ្ធភាព amplification នៃ primers ឈានដល់ 90% -110% ដែលមានន័យថាប្រសិទ្ធភាព amplification គឺល្អ ហើយខ្សែកោងរលាយមានកំពូលតែមួយ ហើយជាធម្មតា Tm>80°C ដែលមានន័យថា ភាពជាក់លាក់នៃ amplification គឺល្អ។
 
ផលិតផលដែលពាក់ព័ន្ធ៖
ពេលវេលាពិត PCR Easy-SYBR GREEN I
ពេលវេលាពិត PCR Easy-Taqman