Fluorescence quantitative PCR (ត្រូវបានគេស្គាល់ផងដែរថាជា TaqMan PCR ដែលក្រោយមកហៅថា FQ-PCR) គឺជាបច្ចេកវិទ្យាបរិមាណអាស៊ីត nucleic ថ្មីដែលត្រូវបានបង្កើតឡើងដោយ PE (Perkin Elmer) នៅសហរដ្ឋអាមេរិកក្នុងឆ្នាំ 1995។ បច្ចេកវិទ្យានេះគឺផ្អែកលើ PCR ធម្មតាដោយបន្ថែមការស៊ើបអង្កេតដែលមានស្លាក fluorescent ។បើប្រៀបធៀបជាមួយ PCR ដែលអាចបត់បែនបាន FQ-PCR មានគុណសម្បត្តិជាច្រើនដើម្បីដឹងពីមុខងារបរិមាណរបស់វា។អត្ថបទនេះមានបំណងពិពណ៌នាសង្ខេបអំពីលក្ខណៈ គោលការណ៍ វិធីសាស្រ្ត និងការប្រើប្រាស់បច្ចេកវិទ្យា។
1 លក្ខណៈពិសេស
FQ-PCR មិនត្រឹមតែមានភាពរសើបខ្ពស់នៃ PCR ធម្មតាប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែវាក៏ដោយសារតែការអនុវត្តនៃ fluorescent probes ផងដែរ វាអាចរកឃើញដោយផ្ទាល់នូវការផ្លាស់ប្តូរនៃសញ្ញា fluorescent កំឡុងពេលពង្រីក PCR តាមរយៈប្រព័ន្ធ photoelectric conduction ដើម្បីទទួលបានលទ្ធផលជាបរិមាណ ដែលជម្នះការខ្វះខាតជាច្រើននៃ PCR ធម្មតា ដូច្នេះវាក៏មានភាពជាក់លាក់ខ្ពស់នៃបច្ចេកវិទ្យា DNA និង hybridization ខ្ពស់។
ឧទាហរណ៍ ផលិតផល PCR ទូទៅត្រូវសង្កេតឃើញដោយសារធាតុ agarose gel electrophoresis និង ethidium bromide ជាមួយនឹងពន្លឺ ultraviolet ឬដោយ electrophoresis polyacrylamide gel និងស្នាមប្រឡាក់ប្រាក់។នេះមិនត្រឹមតែត្រូវការឧបករណ៍ច្រើនមុខប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែក៏ត្រូវការពេលវេលា និងការខំប្រឹងប្រែងផងដែរ។ស្នាមប្រឡាក់ដែលបានប្រើ Ethidium bromide គឺមានគ្រោះថ្នាក់ដល់រាងកាយមនុស្ស ហើយនីតិវិធីពិសោធន៍ដ៏ស្មុគស្មាញទាំងនេះផ្តល់ឱកាសសម្រាប់ការបំពុល និងវិជ្ជមានមិនពិត។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ FQ-PCR ត្រូវការបើកគំរបតែម្តងគត់កំឡុងពេលផ្ទុកគំរូ ហើយដំណើរការបន្តបន្ទាប់គឺប្រតិបត្តិការបំពង់បិទទាំងស្រុង ដែលមិនតម្រូវឱ្យមានការដំណើរការក្រោយ PCR ជៀសវាងគុណវិបត្តិជាច្រើនក្នុងប្រតិបត្តិការ PCR ធម្មតា។ការពិសោធន៍ជាទូទៅប្រើម៉ាស៊ីនកំដៅ ABI7100 PCR ដែលបង្កើតឡើងដោយក្រុមហ៊ុន PE ។
ឧបករណ៍នេះមានលក្ខណៈដូចខាងក្រោម៖ ① កម្មវិធីធំទូលាយ៖ វាអាចត្រូវបានប្រើសម្រាប់បរិមាណផលិតផល DNA និង RNA PCR ការស្រាវជ្រាវហ្សែន ការរកឃើញធាតុបង្កជំងឺ និងការបង្កើនប្រសិទ្ធភាពនៃលក្ខខណ្ឌ PCR ។② គោលការណ៍បរិមាណតែមួយគត់៖ ដោយប្រើការស៊ើបអង្កេតដែលមានស្លាក fluorescent បរិមាណនៃ fluorescence នឹងកកកុញជាមួយនឹងវដ្ត PCR បន្ទាប់ពីការរំភើបដោយឡាស៊ែរ ដើម្បីសម្រេចបាននូវគោលបំណងនៃបរិមាណ។③ ប្រសិទ្ធភាពការងារខ្ពស់៖ ឧបករណ៏កម្ដៅ 9600 PCR ដែលភ្ជាប់មកជាមួយ កុំព្យូទ័របានគ្រប់គ្រងពី 1 ទៅ 2 ម៉ោង ដើម្បីបញ្ចប់ការពង្រីក និងបរិមាណនៃគំរូ 96 ដោយស្វ័យប្រវត្តិ និងធ្វើសមកាលកម្ម។④ មិនចាំបាច់ប្រើ gel electrophoresis៖ មិនចាំបាច់ពនរ និង electrophoresis គំរូនោះទេ គ្រាន់តែប្រើប្រដាប់ស្ទង់ពិសេស ដើម្បីរាវរកដោយផ្ទាល់នៅក្នុងបំពង់ប្រតិកម្ម។⑤ គ្មានការបំពុលនៅក្នុងបំពង់បង្ហូរប្រេង៖ បំពង់ប្រតិកម្មដែលបិទជិតទាំងស្រុង និងប្រព័ន្ធដំណើរការ photoelectric ត្រូវបានអនុម័ត ដូច្នេះមិនចាំបាច់ព្រួយបារម្ភអំពីការបំពុលនោះទេ។⑥ លទ្ធផលគឺអាចផលិតឡើងវិញបាន៖ ជួរថាមវន្តបរិមាណគឺរហូតដល់ប្រាំលំដាប់នៃរ៉ិចទ័រ។ដូច្នេះហើយ ចាប់តាំងពីបច្ចេកវិទ្យានេះត្រូវបានអភិវឌ្ឍដោយជោគជ័យ វាត្រូវបានវាយតម្លៃដោយអ្នកស្រាវជ្រាវវិទ្យាសាស្ត្រជាច្រើន ហើយត្រូវបានអនុវត្តក្នុងវិស័យជាច្រើន។
2 គោលការណ៍ និងវិធីសាស្រ្ត
គោលការណ៍ការងាររបស់ FQ-PCR គឺត្រូវប្រើសកម្មភាព exonuclease 5′→3′ នៃអង់ស៊ីម Taq ដើម្បីបន្ថែមការស៊ើបអង្កេតដែលមានស្លាក fluorescent ទៅប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម PCR ។ការស៊ើបអង្កេតអាចបង្កាត់ជាក់លាក់ជាមួយគំរូ DNA ដែលមាននៅក្នុងលំដាប់បឋម។ចុង 5′ នៃការស៊ើបអង្កេតត្រូវបានដាក់ស្លាកជាមួយនឹងហ្សែនបំភាយហ្វ្លុយអូរីសសេន FAM (6-carboxyfluorescein, កំពូលការបញ្ចេញពន្លឺនៅ 518nm) ហើយចុង 3′ ត្រូវបានដាក់ស្លាកជាមួយនឹងក្រុមពន្លត់ភ្លើងហ្វ្លុយអូរីស TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine 5, the fluorescence at 2) ។ phosphorylated ដើម្បីការពារការស៊ើបអង្កេតពីការពង្រីកកំឡុងពេលពង្រីក PCR ។នៅពេលដែលការស៊ើបអង្កេតនៅដដែល ក្រុម quencher ទប់ស្កាត់ការបំភាយ fluorescence នៃក្រុមបញ្ចេញ។នៅពេលដែលក្រុមបញ្ចេញពន្លឺត្រូវបានបំបែកចេញពីក្រុម quenching ការទប់ស្កាត់ត្រូវបានលើក ហើយដង់ស៊ីតេអុបទិកនៅ 518nm កើនឡើង ហើយត្រូវបានរកឃើញដោយប្រព័ន្ធរាវរកហ្វ្លុយអូរីស។ ក្នុងដំណាក់កាល renaturation ការស៊ើបអង្កេតនឹងបង្កាត់ជាមួយគំរូ DNA ហើយអង់ស៊ីម Taq ក្នុងដំណាក់កាលបន្ថែមផ្លាស់ទីតាមផ្នែកបន្ថែមនៃគំរូ DNA ។នៅពេលដែលការស៊ើបអង្កេតត្រូវបានកាត់ផ្តាច់ ឥទ្ធិពល quenching ត្រូវបានបញ្ចេញ ហើយសញ្ញា fluorescent ត្រូវបានបញ្ចេញ។រាល់ពេលដែលគំរូត្រូវបានចម្លង ការស៊ើបអង្កេតមួយត្រូវបានកាត់ផ្តាច់ អមដោយការបញ្ចេញសញ្ញា fluorescent ។ដោយសារមានទំនាក់ទំនងមួយទល់នឹងមួយរវាងចំនួន fluorophores ដែលបានចេញផ្សាយ និងចំនួនផលិតផល PCR បច្ចេកទេសនេះអាចត្រូវបានប្រើដើម្បីកំណត់បរិមាណគំរូឱ្យបានត្រឹមត្រូវ។ឧបករណ៍ពិសោធន៍ជាទូទៅប្រើឧបករណ៍កង់កម្ដៅ ABI7100 PCR ដែលបង្កើតឡើងដោយក្រុមហ៊ុន PE ហើយឧបករណ៍កង់កម្ដៅផ្សេងទៀតក៏អាចប្រើបានផងដែរ។ប្រសិនបើប្រព័ន្ធប្រតិកម្មប្រភេទ ABI7700 ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការពិសោធន៍ បន្ទាប់ពីប្រតិកម្មត្រូវបានបញ្ចប់ លទ្ធផលបរិមាណអាចត្រូវបានផ្តល់ឱ្យដោយផ្ទាល់តាមរយៈការវិភាគតាមកុំព្យូទ័រ។ប្រសិនបើអ្នកប្រើឧបករណ៍វាស់កម្ដៅផ្សេងទៀត អ្នកត្រូវប្រើឧបករណ៍ចាប់ពន្លឺ ដើម្បីវាស់សញ្ញា fluorescence នៅក្នុងបំពង់ប្រតិកម្មក្នុងពេលតែមួយ ដើម្បីគណនា RQ+, RQ-, △RQ ។RQ+ តំណាងឱ្យសមាមាត្រនៃអាំងតង់ស៊ីតេ luminescence នៃក្រុមបំភាយ fluorescent នៃបំពង់គំរូទៅនឹងអាំងតង់ស៊ីតេ luminescence នៃក្រុម quenching, RQ- តំណាងឱ្យសមាមាត្រនៃទាំងពីរនៅក្នុងបំពង់ទទេ △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) តំណាងឱ្យបរិមាណនៃដំណើរការទិន្នន័យ fluoric RQ ។ដោយសារតែការណែនាំនៃការស៊ើបអង្កេត fluorescent ភាពជាក់លាក់នៃការពិសោធន៍ត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងយ៉ាងខ្លាំង។ការរចនាការស៊ើបអង្កេតជាទូទៅគួរតែបំពេញតាមលក្ខខណ្ឌដូចខាងក្រោមៈ ①ប្រវែងនៃការស៊ើបអង្កេតគួរតែមានប្រហែល 20-40 មូលដ្ឋាន ដើម្បីធានាបាននូវភាពជាក់លាក់នៃការចង។② មាតិកានៃមូលដ្ឋាន GC គឺចន្លោះពី 40% ទៅ 60% ដើម្បីជៀសវាងការចម្លងនៃលំដាប់នុយក្លេអូទីតតែមួយ។③ ជៀសវាងការបង្កាត់ ឬជាន់គ្នាជាមួយថ្នាំ primers ។④ ស្ថេរភាពនៃការចងរវាងការស៊ើបអង្កេត និងគំរូគឺធំជាងស្ថេរភាពនៃការចងរវាង primer និង template ដូច្នេះតម្លៃ Tm នៃ probe គួរតែមានយ៉ាងហោចណាស់ 5°C ខ្ពស់ជាងតម្លៃ Tm នៃ primer ។លើសពីនេះ ការប្រមូលផ្តុំនៃការស៊ើបអង្កេត ភាពដូចគ្នារវាង probe និងលំដាប់គំរូ និងចម្ងាយរវាង probe និង primer សុទ្ធតែមានឥទ្ធិពលលើលទ្ធផលពិសោធន៍។
ផលិតផលដែលពាក់ព័ន្ធ៖
China Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman ក្រុមហ៊ុនផលិត និងផ្គត់ផ្គង់ |Foregene (foreivd.com)
ពេលវេលាផ្សាយ៖ ១៥-តុលា-២០២១
