• PCR គឺជាវិធីសាស្រ្តមួយដែលត្រូវបានប្រើដើម្បីពង្រីក DNA ពីចំនួនតូចមួយនៃគំរូ DNA ។RT-PCR ប្រើការចម្លងបញ្ច្រាសដើម្បីបង្កើតគំរូ DNA ពីប្រភព RNA ដែលបន្ទាប់មកអាចត្រូវបានពង្រីក។
• PCR និង RT-PCR ជាទូទៅគឺជាប្រតិកម្មចំណុចបញ្ចប់ ខណៈពេលដែល qPCR និង RT-qPCR ប្រើ kinetics នៃអត្រានៃការសំយោគផលិតផលក្នុងអំឡុងពេលប្រតិកម្ម PCR ដើម្បីបរិមាណនៃគំរូដែលមានវត្តមាន។
• វិធីសាស្រ្តថ្មីជាងនេះ ដូចជា PCR ឌីជីថល ផ្តល់នូវបរិមាណដាច់ខាតនៃគំរូ DNA ដំបូង ខណៈពេលដែលវិធីសាស្រ្តដូចជា isothermal PCR កាត់បន្ថយតម្រូវការសម្រាប់ឧបករណ៍ថ្លៃ ៗ ដើម្បីផ្តល់លទ្ធផលដែលអាចទុកចិត្តបាន។

ប្រតិកម្មខ្សែសង្វាក់ Polymerase (PCR) គឺជាបច្ចេកទេសជីវវិទ្យាម៉ូលេគុលដ៏សាមញ្ញ និងប្រើប្រាស់យ៉ាងទូលំទូលាយ ដើម្បីពង្រីក និងរកឃើញលំដាប់ DNA និង RNA ។បើប្រៀបធៀបទៅនឹងវិធីសាស្រ្តប្រពៃណីនៃការក្លូន DNA និងការពង្រីកដែលជារឿយៗអាចចំណាយពេលច្រើនថ្ងៃ PCR ត្រូវការតែពីរបីម៉ោងប៉ុណ្ណោះ។PCR មានភាពរសើបខ្លាំង ហើយទាមទារគំរូតិចតួចបំផុតសម្រាប់ការរកឃើញ និងការពង្រីកនៃលំដាប់ជាក់លាក់។វិធីសាស្រ្ត PCR មូលដ្ឋានបានរីកចម្រើនបន្ថែមទៀតពីការរកឃើញ DNA និង RNA សាមញ្ញ។ខាងក្រោមនេះ យើងបានផ្តល់ទិដ្ឋភាពទូទៅនៃវិធីសាស្រ្ត PCR ផ្សេងៗគ្នា និងសារធាតុប្រតិកម្មដែលយើងផ្តល់ជូននៅ Enzo Life Sciences សម្រាប់តម្រូវការស្រាវជ្រាវរបស់អ្នក។យើង​មាន​គោលបំណង​ជួយ​អ្នក​វិទ្យាសាស្ត្រ​ឱ្យ​ឆាប់​ចូល​ប្រើ​សារធាតុ​ PCR ដើម្បី​ប្រើ​ក្នុង​គម្រោង​ស្រាវជ្រាវ​បន្ទាប់​របស់​ពួកគេ!

PCR

សម្រាប់ PCR ស្តង់ដារ អ្វីដែលអ្នកត្រូវការគឺ DNA polymerase, magnesium, nucleotides, primers, DNA template to amplified, and the thermocycler.យន្តការ PCR គឺសាមញ្ញដូចគោលបំណងរបស់វា៖ 1) ខ្សែ DNA ទ្វេ (dsDNA) ត្រូវបានកំដៅ denatured, 2) primers តម្រឹមទៅខ្សែ DNA តែមួយ និង 3) primers ត្រូវបានពង្រីកដោយ DNA polymerase ដែលជាលទ្ធផលនៅក្នុងច្បាប់ចម្លងពីរ។ ខ្សែ DNA ដើម។ដំណើរការ denaturation, annealing, and elongation over a series of temperature and times is known as one cycle of amplification (Fig ។ 1) ។

ជំហាននីមួយៗនៃវដ្តគួរតែត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរសម្រាប់គំរូ និងសំណុំ primer ដែលបានប្រើ។វដ្តនេះត្រូវបានធ្វើម្តងទៀតប្រហែល 20-40 ដង ហើយផលិតផលដែលពង្រីកអាចត្រូវបានវិភាគ ជាធម្មតាដោយជែល agarose (រូបភាព 2) ។

ដោយសារ PCR គឺជាវិធីសាស្ត្ររសើបខ្លាំង ហើយបរិមាណតិចតួចបំផុតត្រូវបានទាមទារសម្រាប់ប្រតិកម្មតែមួយ ការរៀបចំល្បាយមេសម្រាប់ប្រតិកម្មជាច្រើនត្រូវបានណែនាំ។ល្បាយមេត្រូវតែត្រូវបានលាយបញ្ចូលគ្នាយ៉ាងល្អ ហើយបន្ទាប់មកបំបែកដោយចំនួននៃប្រតិកម្ម ធានាថាប្រតិកម្មនីមួយៗនឹងមានបរិមាណដូចគ្នានៃអង់ស៊ីម dNTPs និង primers ។អ្នកផ្គត់ផ្គង់ជាច្រើនដូចជា Enzo Life Sciences ក៏ផ្តល់ជូននូវការលាយ PCR ដែលមានអ្វីគ្រប់យ៉ាងរួចជាស្រេច លើកលែងតែ primers និងគំរូ DNA ។

តំបន់ Guanine/Cytosine-rich (GC-rich) តំណាងឱ្យបញ្ហាប្រឈមនៅក្នុងបច្ចេកទេស PCR ស្តង់ដារ។លំដាប់ដែលសំបូរទៅដោយ GC មានស្ថេរភាពជាងលំដាប់ដែលមានមាតិកា GC ទាប។លើសពីនេះ លំដាប់ដែលសំបូរទៅដោយ GC មានទំនោរបង្កើតរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំដូចជា រង្វិលជុំសក់។ជាលទ្ធផល ខ្សែពីរដែលសំបូរទៅដោយ GC គឺពិបាកក្នុងការបំបែកចេញទាំងស្រុងក្នុងដំណាក់កាល denaturation ។ជាលទ្ធផល DNA polymerase មិនអាចសំយោគខ្សែថ្មីដោយគ្មានឧបសគ្គទេ។សីតុណ្ហភាព denaturation ខ្ពស់អាចធ្វើអោយប្រសើរឡើង ហើយការកែតម្រូវឆ្ពោះទៅរកសីតុណ្ហភាព annealing ខ្ពស់ និងពេលវេលា annealing ខ្លីជាងអាចការពារការចងមិនជាក់លាក់នៃ primers ដែលសំបូរទៅដោយ GC ។សារធាតុបន្ថែមអាចបង្កើនការពង្រីកនៃលំដាប់ដែលសំបូរទៅដោយ GC ។DMSO, glycerol, និង betaine ជួយបង្អាក់រចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំដែលបណ្តាលមកពីអន្តរកម្ម GC ហើយដោយហេតុនេះជួយសម្រួលដល់ការបំបែកនៃខ្សែពីរ។

PCR ចាប់ផ្តើមក្តៅ

ការពង្រីកមិនជាក់លាក់គឺជាបញ្ហាដែលអាចកើតឡើងក្នុងអំឡុងពេល PCR ។DNA polymerase ភាគច្រើនដែលប្រើសម្រាប់ PCR ដំណើរការល្អបំផុតនៅសីតុណ្ហភាពប្រហែល 68°C ទៅ 72°C។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ អង់ស៊ីមក៏អាចមានសកម្មភាពនៅសីតុណ្ហភាពទាបផងដែរ បើទោះបីជាមានកម្រិតទាបជាងក៏ដោយ។នៅសីតុណ្ហភាពទាបជាងសីតុណ្ហភាព annealing, primers អាចចងមិនជាក់លាក់និងនាំឱ្យមានការពង្រីកមិនជាក់លាក់ទោះបីជាប្រតិកម្មត្រូវបានបង្កើតឡើងនៅលើទឹកកក។នេះអាចត្រូវបានរារាំងដោយការប្រើសារធាតុទប់ស្កាត់សារធាតុ polymerase ដែលបំបែកចេញពី DNA polymerase លុះត្រាតែសីតុណ្ហភាពជាក់លាក់មួយត្រូវបានឈានដល់ ដូច្នេះពាក្យថា PCR ចាប់ផ្តើមក្តៅ។inhibitor អាចជាអង្គបដិបក្ខដែលភ្ជាប់វត្ថុធាតុ polymerase និង denatures នៅសីតុណ្ហភាព denaturation ដំបូង (ជាធម្មតា 95°C)។

Polymerase ភាពស្មោះត្រង់ខ្ពស់។

ខណៈពេលដែល DNA polymerases ពង្រីកយ៉ាងត្រឹមត្រូវទៅនឹងលំដាប់គំរូដើម កំហុសក្នុងការផ្គូផ្គងនុយក្លេអូទីតអាចកើតឡើង។ភាពមិនស៊ីគ្នានៅក្នុងកម្មវិធីដូចជាការក្លូនអាចបណ្តាលឱ្យមានប្រតិចារិកដែលត្រូវបានកាត់ឱ្យខ្លី និងប្រូតេអ៊ីនដែលត្រូវបានបកប្រែខុស ឬអសកម្មនៅខាងក្រោម។ដើម្បីជៀសវាងភាពមិនស៊ីគ្នាទាំងនេះ សារធាតុប៉ូលីមេរ៉ាសដែលមានសកម្មភាព "ការអានភស្តុតាង" ត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណ និងបញ្ចូលទៅក្នុងដំណើរការការងារ។ប៉ូលីមេរ៉ាស ភីហ្វូ ត្រូវបានគេរកឃើញនៅឆ្នាំ ១៩៩១ នៅ Pyrococcus furiosus ។អង់ស៊ីម Pfu នេះមានសកម្មភាព exonuclease ពី 3 ទៅ 5' ។នៅពេលដែល DNA ត្រូវបានពង្រីក នោះ exonuclease ដក nucleotides ដែលមិនត្រូវគ្នានៅចុង 3' នៃ strand ។បន្ទាប់មក នុយក្លេអូទីតត្រឹមត្រូវត្រូវបានជំនួស ហើយការសំយោគ DNA នៅតែបន្ត។ការកំណត់អត្តសញ្ញាណនៃលំដាប់នុយក្លេអូទីតមិនត្រឹមត្រូវគឺផ្អែកលើភាពស្អិតរមួតសម្រាប់ nucleoside triphosphate ត្រឹមត្រូវជាមួយនឹងអង់ស៊ីម ដែលការចងមិនមានប្រសិទ្ធភាពធ្វើឱ្យការសំយោគយឺត និងអនុញ្ញាតឱ្យមានការជំនួសត្រឹមត្រូវ។សកម្មភាពអានភស្តុតាងនៃ Pfu polymerase បណ្តាលឱ្យមានកំហុសតិចជាងនៅក្នុងលំដាប់ចុងក្រោយបើប្រៀបធៀបទៅនឹង Taq DNA polymerase ។ក្នុងរយៈពេលប៉ុន្មានឆ្នាំចុងក្រោយនេះ អង់ស៊ីម proofreading ផ្សេងទៀតត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណ ហើយការកែប្រែនៃអង់ស៊ីម Pfu ដើមត្រូវបានធ្វើឡើងដើម្បីកាត់បន្ថយអត្រាកំហុសបន្ថែមទៀតក្នុងអំឡុងពេលពង្រីក DNA ។

RT-PCR

Reverse transcription PCR ឬ RT-PCR អនុញ្ញាតឱ្យប្រើ RNA ជាគំរូមួយ។ជំហានបន្ថែមអនុញ្ញាតឱ្យរកឃើញ និងពង្រីក RNA ។RNA ត្រូវបានចម្លងបញ្ច្រាសទៅជា DNA បំពេញបន្ថែម (cDNA) ដោយប្រើ reverse transcriptase ។គុណភាព និងភាពបរិសុទ្ធនៃគំរូ RNA គឺចាំបាច់សម្រាប់ភាពជោគជ័យនៃ RT-PCR ។ជំហានដំបូងនៃ RT-PCR គឺការសំយោគ DNA/RNA កូនកាត់។Reverse transcriptase ក៏មានមុខងារ RNase H ដែលបំផ្លាញផ្នែក RNA នៃកូនកាត់។បន្ទាប់មក ម៉ូលេគុល DNA ខ្សែតែមួយត្រូវបានបញ្ចប់ដោយសកម្មភាព DNA polymerase ដែលពឹងផ្អែកលើ DNA នៃ transcriptase បញ្ច្រាសទៅក្នុង cDNA ។ប្រសិទ្ធភាពនៃប្រតិកម្មខ្សែទីមួយអាចប៉ះពាល់ដល់ដំណើរការពង្រីក។ចាប់ពីពេលនេះតទៅ នីតិវិធី PCR ស្តង់ដារត្រូវបានប្រើដើម្បីពង្រីក cDNA ។លទ្ធភាពក្នុងការបំប្លែង RNA ទៅជា cDNA ដោយ RT-PCR មានគុណសម្បត្តិជាច្រើន ហើយវាត្រូវបានប្រើជាចម្បងសម្រាប់ការវិភាគការបញ្ចេញហ្សែន។RNA គឺជាខ្សែតែមួយ និងមិនស្ថិតស្ថេរខ្លាំង ដែលធ្វើឱ្យវាពិបាកក្នុងការធ្វើការជាមួយ។ជាទូទៅវាដើរតួជាជំហានដំបូងនៅក្នុង qPCR ដែលកំណត់បរិមាណប្រតិចារឹក RNA នៅក្នុងគំរូជីវសាស្រ្ត។

qPCR និង RT-qPCR

Quantitative PCR (qPCR) ត្រូវបានប្រើដើម្បីស្វែងរក កំណត់លក្ខណៈ និងបរិមាណអាស៊ីត nucleic សម្រាប់កម្មវិធីជាច្រើន។នៅក្នុង RT-qPCR ប្រតិចារឹក RNA ជាញឹកញាប់ត្រូវបានកំណត់បរិមាណដោយការចម្លងពួកវាទៅក្នុង cDNA ជាមុនសិន ដូចដែលបានពិពណ៌នាខាងលើ ហើយបន្ទាប់មក qPCR ត្រូវបានអនុវត្តជាបន្តបន្ទាប់។ដូចនៅក្នុង PCR ស្តង់ដារ DNA ត្រូវបានពង្រីកដោយបីជំហានម្តងហើយម្តងទៀត៖ denaturation, annealing, និងការពន្លូត។ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយនៅក្នុង qPCR ការដាក់ស្លាក fluorescent អនុញ្ញាតឱ្យការប្រមូលទិន្នន័យនៅពេលដែល PCR ដំណើរការ។បច្ចេកទេសនេះមានអត្ថប្រយោជន៍ជាច្រើនដោយសារតែជួរនៃវិធីសាស្រ្ត និងគីមីសាស្ត្រដែលមាន។

នៅក្នុង qPCR ដែលមានមូលដ្ឋានលើថ្នាំជ្រលក់ (ជាទូទៅពណ៌បៃតង) ការដាក់ស្លាកសញ្ញា fluorescent អនុញ្ញាតឱ្យកំណត់បរិមាណនៃម៉ូលេគុល DNA ដែលត្រូវបានពង្រីកដោយប្រើប្រាស់ការប្រើប្រាស់ថ្នាំជ្រលក់ចង dsDNA ។ក្នុងអំឡុងពេលវដ្តនីមួយៗ fluorescence ត្រូវបានវាស់។សញ្ញា fluorescence កើនឡើងតាមសមាមាត្រទៅនឹងបរិមាណ DNA ចម្លង។ដូច្នេះ DNA ត្រូវបានកំណត់ជាបរិមាណនៅក្នុង "ពេលវេលាពិត" (រូបភាពទី 3) ។គុណវិបត្តិនៃការជ្រលក់ពណ៌ដែលមានមូលដ្ឋានលើ qPCR គឺថាមានតែគោលដៅមួយប៉ុណ្ណោះដែលអាចពិនិត្យបានក្នុងពេលតែមួយ ហើយថ្នាំជ្រលក់នឹងភ្ជាប់ទៅនឹង ds-DNA ណាមួយដែលមាននៅក្នុងគំរូ។

នៅក្នុង qPCR ដែលមានមូលដ្ឋានលើការស៊ើបអង្កេត គោលដៅជាច្រើនអាចត្រូវបានរកឃើញក្នុងពេលដំណាលគ្នានៅក្នុងគំរូនីមួយៗ ប៉ុន្តែនេះតម្រូវឱ្យមានការបង្កើនប្រសិទ្ធភាព និងការរចនានៃការស៊ើបអង្កេតជាក់លាក់គោលដៅដែលប្រើបន្ថែមលើ primers ។ការរចនាការស៊ើបអង្កេតមានច្រើនប្រភេទ ប៉ុន្តែប្រភេទទូទៅបំផុតគឺការស៊ើបអង្កេតអ៊ីដ្រូលីស៊ីស ដែលរួមបញ្ចូលហ្វ្លុយរ៉ូហ្វ័រ និងឧបករណ៍ពន្លត់។ការផ្ទេរថាមពលអនុភាពហ្វ្លុយអូរីសសិន (FRET) ការពារការបំភាយ ហ្វ្លុយរ៉ូហ្វ័រ តាមរយៈឧបករណ៍ពន្លត់ភ្លើង ខណៈពេលដែលការស៊ើបអង្កេតនៅដដែល។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយក្នុងអំឡុងពេលប្រតិកម្ម PCR ការស៊ើបអង្កេតត្រូវបាន hydrolyzed កំឡុងពេលការបន្ថែម primer និងការពង្រីកនៃលំដាប់ជាក់លាក់ដែលវាត្រូវបានចង។ការបំបែកនៃប្រដាប់ស្ទង់បំបែក fluorophore ពី quencher និងបណ្តាលឱ្យមានការកើនឡើងអាស្រ័យលើ amplification នៃ fluorescence (រូបភាព 4) ។ដូច្នេះ សញ្ញា fluorescence ពីប្រតិកម្ម qPCR ដែលមានមូលដ្ឋានលើការស៊ើបអង្កេតគឺសមាមាត្រទៅនឹងបរិមាណនៃលំដាប់គោលដៅស៊ើបអង្កេតដែលមាននៅក្នុងគំរូ។ដោយសារតែ qPCR ដែលមានមូលដ្ឋានលើការស៊ើបអង្កេតមានភាពជាក់លាក់ជាង qPCR ដែលមានមូលដ្ឋានលើថ្នាំជ្រលក់ វាជារឿយៗជាបច្ចេកវិជ្ជាដែលប្រើក្នុងការវិភាគរោគវិនិច្ឆ័យដែលមានមូលដ្ឋានលើ qPCR ។

ការពង្រីក Isothermal

បច្ចេកទេស PCR ដែលបានរៀបរាប់ខាងលើតម្រូវឱ្យមានឧបករណ៍កម្តៅដែលមានតម្លៃថ្លៃ ដើម្បីបង្កើន និងចុះសីតុណ្ហភាពក្នុងបន្ទប់ឱ្យបានត្រឹមត្រូវសម្រាប់ជំហាន denaturation, annealing និងផ្នែកបន្ថែម។បច្ចេកទេសមួយចំនួនត្រូវបានបង្កើតឡើងដែលមិនត្រូវការឧបករណ៍ច្បាស់លាស់បែបនេះ ហើយអាចត្រូវបានអនុវត្តនៅក្នុងអាងងូតទឹកធម្មតា ឬសូម្បីតែនៅក្នុងកោសិកាដែលចាប់អារម្មណ៍។បច្ចេកទេសទាំងនេះត្រូវបានគេហៅថាជាសមូហភាព isothermal amplification និងធ្វើការដោយផ្អែកលើ exponential, linear, or cascade amplification។

ប្រភេទនៃការពង្រីក isothermal ដែលល្បីជាងគេគឺការពង្រីក isothermal ដែលត្រូវបានសម្រួលដោយរង្វិលជុំ ឬ LAMP ។ចង្កៀងប្រើការពង្រីកអិចស្ប៉ូណង់ស្យែលនៅ 65⁰C ដើម្បីពង្រីកគំរូ DNA ឬ RNA ។នៅពេលអនុវត្ត LAMP សារធាតុ primers ពី 4 ទៅ 6 ដែលបំពេញបន្ថែមក្នុងតំបន់នៃ DNA គោលដៅត្រូវបានប្រើប្រាស់ជាមួយនឹង DNA polymerase ដើម្បីសំយោគ DNA ថ្មី។ថ្នាំ primers ទាំងពីរនេះមានលំដាប់អនុគ្រោះដែលទទួលស្គាល់លំដាប់នៅក្នុង primers ផ្សេងទៀត និងចងពួកវា ដែលអនុញ្ញាតឱ្យមានរចនាសម្ព័ន្ធ "loop" ដើម្បីបង្កើតនៅក្នុង DNA ដែលបានសំយោគថ្មី ដែលបន្ទាប់មកជួយ primer annealing នៅក្នុងជុំបន្តបន្ទាប់នៃ amplification ។ចង្កៀងអាចត្រូវបានមើលឃើញដោយវិធីសាស្រ្តជាច្រើនរួមទាំង fluorescence, agarose gel electrophoresis ឬ colorimetry ។ភាពងាយស្រួលនៃការមើលឃើញ និងការរកឃើញវត្តមាន ឬអវត្តមាននៃផលិតផលដោយ colorimetry និងកង្វះខាតឧបករណ៍ថ្លៃៗដែលទាមទារបានធ្វើឱ្យ LAMP ជាជម្រើសដ៏សមរម្យសម្រាប់ការធ្វើតេស្ត SARS-CoV-2 នៅក្នុងតំបន់ដែលការធ្វើតេស្តមន្ទីរពិសោធន៍មិនមានលទ្ធភាពប្រើប្រាស់បាន ឬការផ្ទុក និងការដឹកជញ្ជូនគំរូ មិនអាចទៅរួច ឬនៅក្នុងមន្ទីរពិសោធន៍ដែលពីមុនមិនមានឧបករណ៍កំដៅ PCR ។