1. ចំណេះដឹងជាមូលដ្ឋាន (ប្រសិនបើអ្នកចង់ឃើញផ្នែកពិសោធន៍ សូមផ្ទេរដោយផ្ទាល់ទៅផ្នែកទីពីរ)

ជាប្រតិកម្មដេរីវេនៃ PCR ធម្មតា ពេលវេលាពិត PCR ត្រួតពិនិត្យជាចម្បងលើការផ្លាស់ប្តូរបរិមាណនៃផលិតផល amplification នៅក្នុងវដ្តនីមួយៗនៃប្រតិកម្ម PCR amplification ក្នុងពេលវេលាជាក់ស្តែងតាមរយៈការផ្លាស់ប្តូរនៃសញ្ញា fluorescence និងវិភាគបរិមាណនៃគំរូចាប់ផ្តើមតាមរយៈទំនាក់ទំនងរវាងតម្លៃ ct និងខ្សែកោងស្តង់ដារ។

ទិន្នន័យជាក់លាក់នៃ RT-PCR គឺបន្ទាត់មូលដ្ឋាន, កម្រិត fluorescenceនិងតម្លៃ Ct ។

វិធីសាស្ត្រដាក់ស្លាកទូទៅសម្រាប់ RT-PCR៖

2. ជំហានពិសោធន៍

2.1 អំពីក្រុមពិសោធន៍- ត្រូវតែមានអណ្តូងជាច្រើននៅក្នុងក្រុម ហើយត្រូវតែមានពាក្យដដែលៗជីវសាស្រ្ត។

2.2 គោលការណ៍នៃការរចនាបឋម

①SiRNA គឺជាប្រភេទសត្វជាក់លាក់ ហើយលំដាប់នៃប្រភេទផ្សេងៗគ្នានឹងខុសគ្នា។

②SiRNA ត្រូវ​បាន​ខ្ចប់​ជា​ម្សៅ​ស្ងួត ដែល​អាច​រក្សា​ទុក​បាន​យ៉ាង​ឋិតថេរ​រយៈពេល 2-4 សប្តាហ៍​នៅ​សីតុណ្ហភាព​បន្ទប់។

2.3 ឧបករណ៍ឬសារធាតុដែលចាំបាច់ត្រូវរៀបចំជាមុន

2.4 ទាក់ទងនឹងបញ្ហាដែលត្រូវយកចិត្តទុកដាក់ក្នុងជំហានពិសោធន៍ជាក់លាក់៖

① ដំណើរការផ្ទេរ siRNA

1. សម្រាប់ការដាក់ចាន អ្នកអាចជ្រើសរើសចាន 24 អណ្តូង ចាន 12 អណ្តូង ឬចាន 6 អណ្តូង (កំហាប់ RNA ជាមធ្យមដែលបានស្នើឡើងក្នុងអណ្តូងនីមួយៗនៃ 24 អណ្តូងគឺប្រហែល 100-300 ng/uL) ហើយដង់ស៊ីតេនៃការបញ្ជូនល្អបំផុតនៃកោសិកាគឺរហូតដល់ 60%-80% ឬដូច្នេះ។

2. ជំហាននៃការឆ្លង និងតម្រូវការជាក់លាក់គឺយ៉ាងតឹងរ៉ឹងស្របតាមការណែនាំ។

3. បន្ទាប់ពីការចម្លង គំរូអាចត្រូវបានប្រមូលក្នុងរយៈពេល 24-72 ម៉ោងសម្រាប់ការរកឃើញ mRNA (RT-PCR) ឬការរកឃើញប្រូតេអ៊ីនក្នុងរយៈពេល 48-96 ម៉ោង (WB)

② ដំណើរការទាញយក RNA

1. ការពារការចម្លងរោគដោយអង់ស៊ីម exogenous ។វារួមបញ្ចូលទាំងការពាក់ម៉ាស់ និងស្រោមដៃយ៉ាងតឹងរ៉ឹង។ដោយប្រើគន្លឹះបំពង់មាប់មគ និងបំពង់ EP;ទឹកដែលប្រើក្នុងការពិសោធន៍ត្រូវតែជា RNase-Free។

2. វាត្រូវបានផ្ដល់អនុសាសន៍ឱ្យធ្វើពីរដងដូចដែលបានណែនាំនៅក្នុងឧបករណ៍ទាញយករហ័ស ដែលពិតជានឹងធ្វើអោយប្រសើរឡើងនូវភាពបរិសុទ្ធ និងទិន្នផល។

3. សារធាតុរាវកាកសំណល់មិនត្រូវប៉ះជួរឈរ RNA ។

③ បរិមាណ RNA

បន្ទាប់ពី RNA ត្រូវបានស្រង់ចេញ វាអាចត្រូវបានកំណត់បរិមាណដោយផ្ទាល់ជាមួយ Nanodrop ហើយការអានអប្បបរមាអាចទាបរហូតដល់ 10ng/ul។

④ ដំណើរការចម្លងបញ្ច្រាស

1. ដោយសារតែភាពប្រែប្រួលខ្ពស់នៃ RT-qPCR យ៉ាងហោចណាស់អណ្តូងប៉ារ៉ាឡែល 3 គួរតែត្រូវបានបង្កើតឡើងសម្រាប់គំរូនីមួយៗ ដើម្បីការពារ Ct ជាបន្តបន្ទាប់ពីភាពខុសគ្នាខ្លាំងពេក ឬ SD មានទំហំធំពេកសម្រាប់ការវិភាគស្ថិតិ។

2. កុំបង្កកនិងរលាយ Master លាយម្តងហើយម្តងទៀត។

3. បំពង់/រន្ធនីមួយៗត្រូវតែត្រូវបានជំនួសដោយព័ត៌មានជំនួយថ្មី!កុំបន្តប្រើចុងបំពង់ដូចគ្នា ដើម្បីបន្ថែមគំរូ!

4. ខ្សែភាពយន្តដែលភ្ជាប់ទៅនឹងចានអណ្តូង 96 បន្ទាប់ពីបន្ថែមគំរូចាំបាច់ត្រូវធ្វើឱ្យរលោងជាមួយនឹងចាន។វាជាការល្អបំផុតក្នុងការដាក់ centrifuge មុនពេលដាក់វានៅលើម៉ាស៊ីន ដើម្បីឱ្យវត្ថុរាវនៅលើជញ្ជាំងបំពង់អាចហូរចុះក្រោម និងយកពពុះខ្យល់ចេញ។

⑤ ការវិភាគខ្សែកោងទូទៅ

2.5 អំពីការវិភាគទិន្នន័យ

ការវិភាគទិន្នន័យរបស់ qPCR អាចត្រូវបានបែងចែកជាបរិមាណទាក់ទង និងបរិមាណដាច់ខាត។ជាឧទាហរណ៍ កោសិកាក្នុងក្រុមព្យាបាល ប្រៀបធៀបជាមួយកោសិកាក្នុងក្រុមត្រួតពិនិត្យ

តើ mRNA នៃហ្សែន X ផ្លាស់ប្តូរប៉ុន្មានដង នេះគឺជាបរិមាណទាក់ទង។នៅក្នុងចំនួនជាក់លាក់នៃកោសិកា mRNA នៃហ្សែន X

តើមានច្បាប់ចម្លងចំនួនប៉ុន្មាន នេះជាបរិមាណដាច់ខាត។ជាធម្មតាអ្វីដែលយើងប្រើច្រើនបំផុតនៅក្នុងមន្ទីរពិសោធន៍គឺវិធីសាស្ត្របរិមាណទាក់ទង។ជាធម្មតាវិធីសាស្រ្ត 2-ΔΔctត្រូវ​បាន​គេ​ប្រើ​ច្រើន​បំផុត​ក្នុង​ការ​ពិសោធន៍ ដូច្នេះ​មាន​តែ​វិធីសាស្ត្រ​នេះ​ប៉ុណ្ណោះ​ដែល​ត្រូវ​បាន​ណែនាំ​ឱ្យ​បាន​លម្អិត​នៅ​ទីនេះ។

វិធីសាស្រ្ត 2-ΔΔct: លទ្ធផលដែលទទួលបានគឺភាពខុសគ្នានៃការបញ្ចេញហ្សែនគោលដៅនៅក្នុងក្រុមពិសោធន៍ទាក់ទងទៅនឹងហ្សែនគោលដៅនៅក្នុងក្រុមត្រួតពិនិត្យ។វាត្រូវបានទាមទារថា ប្រសិទ្ធភាពពង្រីកនៃទាំងហ្សែនគោលដៅ និងហ្សែនយោងខាងក្នុងគឺជិតដល់ 100% ហើយគម្លាតដែលទាក់ទងមិនគួរលើសពី 5% ទេ។

វិធីសាស្ត្រគណនាមានដូចខាងក្រោម៖

ក្រុមត្រួតពិនិត្យ Δct = តម្លៃ ct នៃហ្សែនគោលដៅនៅក្នុងក្រុមត្រួតពិនិត្យ - តម្លៃ ct នៃហ្សែនយោងខាងក្នុងនៅក្នុងក្រុមត្រួតពិនិត្យ

ក្រុមពិសោធន៍ Δct = តម្លៃ ct នៃហ្សែនគោលដៅក្នុងក្រុមពិសោធន៍ - តម្លៃ ct នៃហ្សែនយោងខាងក្នុងនៅក្នុងក្រុមពិសោធន៍

ΔΔct=Δct ក្រុមពិសោធន៍-Δct ក្រុមត្រួតពិនិត្យ

ជាចុងក្រោយ គណនាពហុគុណនៃភាពខុសគ្នាក្នុងកម្រិតកន្សោម៖

ផ្លាស់ប្តូរ Fold = 2-ΔΔct (ដែលត្រូវគ្នានឹងមុខងារ excel គឺ POWER)

ផលិតផលដែលពាក់ព័ន្ធ៖

ឧបករណ៍ Cell Direct RT-qPCR