Ⅰ. បង្កើនភាពប្រែប្រួលនៃប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម៖

1. ដាច់ដោយឡែក RNA ដែលមានគុណភាពខ្ពស់៖

ការសំយោគ cDNA ជោគជ័យបានមកពី RNA ដែលមានគុណភាពខ្ពស់។RNA ដែលមានគុណភាពខ្ពស់គួរតែធានាបានយ៉ាងហោចណាស់រយៈពេលវែង និងមិនមានសារធាតុរារាំងដែលមិនមានអង់ស៊ីមថតសំឡេង ដូចជា EDTA ឬ SDS ជាដើម។គុណភាពនៃ RNA កំណត់តម្លៃអតិបរមានៃព័ត៌មានលំដាប់ដែលអ្នកអាចចម្លងទៅ cDNA ។វិធីសាស្រ្តបន្សុត RNA ទូទៅគឺជាវិធីសាស្រ្តជំហាននៃការប្រើ isoocyanate/acidophenol ។ដើម្បីការពារការបំពុលនៃ RNase RNA ដែលបំបែកចេញពីសំណាកដែលសំបូរទៅដោយ RNase (ដូចជាលំពែង) ទាមទារការផ្ទុកសារធាតុ formaldehyde ដើម្បីរក្សាទុក RNA ដែលមានគុណភាពខ្ពស់ ដែលវារឹតតែច្រើនសម្រាប់ការផ្ទុករយៈពេលវែង។RNA ស្រង់ចេញពីថ្លើមកណ្តុរត្រូវបានបង្ខូចទ្រង់ទ្រាយជាមូលដ្ឋានបន្ទាប់ពីការរក្សាទុកក្នុងទឹកមួយសប្តាហ៍ ខណៈដែល RNA ចម្រាញ់ចេញពីលំពែងរបស់កណ្តុរនៅតែមានស្ថេរភាពបន្ទាប់ពីរក្សាទុកក្នុងទឹករយៈពេល 3 ឆ្នាំ។លើសពីនេះ ប្រតិចារិកធំជាង 4kb មានភាពរសើបក្នុងការតាមដានការរិចរិល RNase ជាងប្រតិចារិកតូចៗ។ដើម្បីបង្កើនស្ថេរភាពនៃសំណាក RNA ផ្ទុក RNA អាចត្រូវបានរំលាយនៅក្នុងមេតាឡាមីននៃអ៊ីយ៉ុង ហើយត្រូវបានរក្សាទុក -70 ° C ។Thylide ដែលប្រើដើម្បីរក្សាទុក RNA មិនត្រូវមានវត្ថុផ្សេងៗដែលបំផ្លាញ RNA ឡើយ។RNA ដែល​បាន​មក​ពី​លំពែង​អាច​ត្រូវ​បាន​រក្សា​ទុក​នៅ​ក្នុង​មេតាឡាមីន​យ៉ាង​ហោច​ណាស់​មួយ​ឆ្នាំ។នៅពេលអ្នករួចរាល់ក្នុងការប្រើប្រាស់ RNA អ្នកអាចប្រើវិធីដូចខាងក្រោមដើម្បី precipitate RNA: បន្ថែម NaCl ទៅ 0.2m និង 4 ដងនៃបរិមាណអេតាណុល ដាក់សីតុណ្ហភាពក្នុងបន្ទប់រយៈពេល 3-5 នាទី និង 10,000 × g centrifugal រយៈពេល 5 នាទី។

2. ប្រើ reverse transcriptase ដោយគ្មានសកម្មភាព RNaseH (RNaseH-):

ថ្នាំ RNase inhibitors ត្រូវបានបន្ថែមជាញឹកញាប់ទៅនឹងប្រតិកម្មចម្លងបញ្ច្រាសដើម្បីបង្កើនរយៈពេល និងទិន្នផលនៃការសំយោគ cDNA ។ថ្នាំ RNase inhibitor ត្រូវបានបន្ថែមនៅក្នុងប្រតិកម្មសំយោគខ្សែសង្វាក់ដំបូងនៅក្នុងវត្តមានរបស់ buffers និងភ្នាក់ងារកាត់បន្ថយដូចជា DTT ដោយសារតែដំណើរការសំយោគមុន cDNA denatures សារធាតុ inhibitor ដោយហេតុនេះបញ្ចេញ RNases ដែលបង្ខូច RNA ។Protein RNase inhibitor គ្រាន់តែការពារការរិចរិលនៃ RNA ដោយ RNase A, B, C និងមិនការពារ RNases នៅលើស្បែក ដូច្នេះការយកចិត្តទុកដាក់មិនគួរណែនាំ RNases ពីម្រាមដៃទេ បើទោះបីជាប្រើសារធាតុ inhibitors ទាំងនេះក៏ដោយ។

Reverse transcriptase ជំរុញការបំប្លែង RNA ទៅជា cDNA ។ទាំង M-MLV និង AMV មានសកម្មភាព RNaseH endogenous បន្ថែមពីលើសកម្មភាព polymerase ផ្ទាល់របស់ពួកគេ។សកម្មភាព RNaseH ប្រកួតប្រជែងជាមួយនឹងសកម្មភាព polymerase សម្រាប់ខ្សែតំណពូជដែលបង្កើតឡើងរវាងគំរូ RNA និង DNA primers ឬខ្សែផ្នែកបន្ថែម cDNA និងធ្វើឱ្យខូចគុណភាព RNA: ខ្សែ RNA នៅក្នុងស្មុគស្មាញ DNA ។គំរូ RNA ដែលខូចដោយសកម្មភាព RNaseH មិនអាចប្រើជាស្រទាប់ខាងក្រោមដ៏មានប្រសិទ្ធភាពសម្រាប់ការសំយោគ cDNA ទៀតទេ ដោយកាត់បន្ថយទិន្នផល និងរយៈពេលនៃការសំយោគ cDNA ។ដូច្នេះការលុបបំបាត់ ឬកាត់បន្ថយយ៉ាងខ្លាំងនូវសកម្មភាព RNaseH នៃ transcriptase បញ្ច្រាសនឹងមានអត្ថប្រយោជន៍ដ៏អស្ចារ្យ។

SuperScriptⅡ reverse transcriptase, MMLV reverse transcriptase នៃ RNaseH- និង thermoScript reverse transcriptase, AMV នៃ RNaseH- ផ្តល់ទិន្នផល cDNA ប្រវែងពេញជាង MMLV និង AMV ។ភាពប្រែប្រួល RT-PCR ត្រូវបានប៉ះពាល់ដោយបរិមាណនៃ cDNA សំយោគ។ThermoScript គឺមានភាពរសើបជាង AMV ។ទំហំនៃផលិតផល RT-PCR ត្រូវបានកំណត់ដោយសមត្ថភាពនៃ transcriptase បញ្ច្រាសដើម្បីសំយោគ cDNA ជាពិសេសនៅពេលក្លូន Cdnas ធំជាង។បើប្រៀបធៀបជាមួយ MMLV SuperScripⅡបានបង្កើនទិន្នផលនៃផលិតផល RT-PCR ដ៏យូរ។ការចម្លងបញ្ច្រាសរបស់ RNaseH- ក៏បង្កើនស្ថេរភាពកម្ដៅផងដែរ ដូច្នេះប្រតិកម្មអាចត្រូវបានអនុវត្តនៅសីតុណ្ហភាពខ្ពស់ជាងធម្មតានៃ 37-42 ℃។នៅក្រោមលក្ខខណ្ឌនៃការសំយោគដែលបានស្នើនោះ primers oligo(dT) និង 10μCi [alpha-p]dCTP ត្រូវបានប្រើប្រាស់។ផលិតកម្មសរុបនៃខ្សែសង្វាក់ទីមួយត្រូវបានគណនាដោយប្រើវិធីសាស្ត្រទឹកភ្លៀង TCA ។cDNA ប្រវែងពេញត្រូវបានវិភាគដោយប្រើការដកបន្ទះដែលតម្រៀបតាមទំហំ និងរាប់ក្នុងជែល agarose អាល់កាឡាំង។

3. បង្កើនសីតុណ្ហភាពរក្សាកំដៅនៃការចម្លងបញ្ច្រាស៖

សីតុណ្ហភាពកាន់ខ្ពស់ជួយបើករចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំនៃ RNA និងបង្កើនទិន្នផលនៃប្រតិកម្ម។សម្រាប់គំរូ RNA ភាគច្រើន ការសង្កត់ RNA និង primer នៅសីតុណ្ហភាព 65 ° C ដោយគ្មានសតិបណ្ដោះអាសន្ន ឬអំបិល ហើយបន្ទាប់មកធ្វើឱ្យពួកវាត្រជាក់យ៉ាងលឿននៅលើទឹកកកលុបបំបាត់រចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំភាគច្រើន និងអនុញ្ញាតឱ្យ primers ចង។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ គំរូមួយចំនួននៅតែមានរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំ សូម្បីតែបន្ទាប់ពីការប្រែពណ៌ដោយកម្ដៅក៏ដោយ។ការពង្រីកគំរូដ៏លំបាកទាំងនេះអាចត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើ ThermoScript reverse transcriptase និងដោយការដាក់ប្រតិកម្ម transcriptase បញ្ច្រាសនៅសីតុណ្ហភាពខ្ពស់ជាង ដើម្បីកែលម្អការពង្រីក។សីតុណ្ហភាពកាន់ខ្ពស់ក៏អាចបង្កើនភាពជាក់លាក់ផងដែរ ជាពិសេសនៅពេលដែលការសំយោគ cDNA ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើ primers ជាក់លាក់នៃហ្សែន (GSPS) (សូមមើលជំពូកទី 3)។ប្រសិនបើប្រើ GSP សូមប្រាកដថាតម្លៃ Tm នៃ primer គឺដូចគ្នាទៅនឹងសីតុណ្ហភាពដែលរំពឹងទុក។កុំប្រើ oligo (dT) និង primers ចៃដន្យលើសពី 60 ℃។ថ្នាំ primers ចៃដន្យត្រូវរក្សាទុកនៅ 25 ℃ 10 នាទីមុនពេលកើនឡើងដល់ 60 ℃។បន្ថែមពីលើការប្រើសីតុណ្ហភាពប្រតិចារិកបញ្ច្រាសខ្ពស់ ភាពជាក់លាក់អាចត្រូវបានកែលម្អដោយការផ្ទេរដោយផ្ទាល់នូវល្បាយ RNA/ primer ពីសីតុណ្ហភាព denaturing 65 ℃ ទៅសីតុណ្ហភាពរក្សាប្រតិចារិកបញ្ច្រាស ហើយបន្ថែមល្បាយប្រតិកម្ម 2 × ដែលគេឱ្យឈ្មោះថា (ការសំយោគការចាប់ផ្តើមកំដៅ cDNA) ។វិធីសាស្រ្តនេះជួយការពារការផ្គូផ្គងមូលដ្ឋានអន្តរម៉ូលេគុលដែលកើតឡើងនៅសីតុណ្ហភាពទាប។ការប្រើប្រាស់ឧបករណ៍ PCR ជួយសម្រួលដល់កុងតាក់សីតុណ្ហភាពជាច្រើនដែលត្រូវការសម្រាប់ RT-PCR ។

ប៉ូលីមេរ៉ាសដែលមានស្ថេរភាពកំដៅ Tth ដើរតួជា DNA polymerase នៅក្នុងវត្តមានរបស់ Mg2+ និង RNA polymerase នៅក្នុងវត្តមានរបស់ Mn2+ ។វាអាចរក្សាកំដៅបានរហូតដល់ 65 ℃។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ វត្តមានរបស់ Mn2+ កំឡុងពេល PCR កាត់បន្ថយភាពស្មោះត្រង់ ដែលធ្វើឱ្យ Tth polymerase មិនសូវសមរម្យសម្រាប់ការពង្រីកភាពជាក់លាក់ខ្ពស់ ដូចជាការក្លូន cDNA ជាដើម។លើសពីនេះ Tth មានប្រសិទ្ធភាពតិចក្នុងការចម្លងបញ្ច្រាស ដែលកាត់បន្ថយភាពរសើប ហើយដោយសារអង់ស៊ីមតែមួយអាចធ្វើប្រតិចារិកបញ្ច្រាស និង PCR ប្រតិកម្មគ្រប់គ្រងដោយគ្មានការចម្លងបញ្ច្រាសមិនអាចប្រើដើម្បីសម្គាល់ផលិតផលពង្រីកនៃ cDNA ពី DNA ហ្សែនដែលកខ្វក់នោះទេ។

4. សារធាតុបន្ថែមដែលជំរុញការចម្លងបញ្ច្រាស៖

ការបន្ថែមសារធាតុបន្ថែម រួមទាំងគ្លីសេរីន និង DMSO ទៅនឹងប្រតិកម្មសំយោគខ្សែសង្វាក់ទីមួយអាចកាត់បន្ថយស្ថេរភាពនៃខ្សែសង្វាក់ពីរនៃអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីក និងធ្វើឱ្យរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំរបស់ RNA ធូរស្រាល។រហូតដល់ទៅ 20% glycerin ឬ 10% DMSO អាចត្រូវបានបន្ថែមដោយមិនប៉ះពាល់ដល់សកម្មភាពរបស់ SuperScriptⅡ ឬ MMLV ។AMV ក៏អាចទ្រាំទ្របានរហូតដល់ 20% glycerol ដោយមិនកាត់បន្ថយសកម្មភាព។ដើម្បីបង្កើនភាពប្រែប្រួលនៃ RT-PCR នៅក្នុងប្រតិកម្មបញ្ច្រាស SuperScriptⅡ គ្លីសេរីន 10% អាចត្រូវបានបន្ថែម និងអ៊ីសូឡង់នៅសីតុណ្ហភាព 45 ℃។ប្រសិនបើ 1/10 នៃផលិតផលប្រតិកម្ម retrotranscription-reaction ត្រូវបានបន្ថែមទៅ PCR នោះកំហាប់នៃ glycerol នៅក្នុងប្រតិកម្ម amplification គឺ 0.4% ដែលមិនគ្រប់គ្រាន់ដើម្បីរារាំង PCR ។

5. ដំណើរការ RNaseH៖

ភាពប្រែប្រួលអាចត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងដោយការព្យាបាលប្រតិកម្មសំយោគ cDNA ជាមួយ RNaseH មុនពេល PCR ។សម្រាប់គំរូមួយចំនួន វាត្រូវបានគេគិតថា RNA នៅក្នុងប្រតិកម្មសំយោគ cDNA ការពារការផ្សារភ្ជាប់នៃផលិតផល amplified ក្នុងករណីនេះការព្យាបាល RNaseH អាចបង្កើនភាពប្រែប្រួល។ជាទូទៅ ការព្យាបាល RNaseH គឺត្រូវបានទាមទារសម្រាប់ការពង្រីកនៃគំរូគោលដៅ cDNA ប្រវែងវែងដែលទាក់ទងដូចជា scherosis មើមⅡ ជាមួយនឹងច្បាប់ចម្លងទាប។សម្រាប់គំរូដ៏លំបាកនេះ RNaseH បានពង្រឹងសញ្ញាដែលបង្កើតដោយ cDNA សំយោគដោយ SuperScriptⅡ ឬ AMV ។សម្រាប់ប្រតិកម្ម RT-PCR ភាគច្រើន ការព្យាបាល RNaseH គឺស្រេចចិត្តព្រោះជំហាន denaturation PCR ដែលមានអ៊ីសូឡង់ 95 ℃ ជាធម្មតាធ្វើអ៊ីដ្រូលីស RNA ពី RNA: DNA complex ។

6. វិធីសាស្រ្តធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងសម្រាប់ការរកឃើញបរិមាណតិចតួចនៃ RNA:

RT-PCR មានការលំបាកជាពិសេសនៅពេលដែលមាន RNA តិចតួចប៉ុណ្ណោះ។ការបន្ថែម glycogen ជាក្រុមហ៊ុនដឹកជញ្ជូនក្នុងអំឡុងពេលការបំបែក RNA ជួយបង្កើនទិន្នផលនៃគំរូតូចៗ។អាចបន្ថែម glycogen ដោយគ្មាន RNase ក្នុងពេលតែមួយជាមួយ Trizol ។Glycogen គឺរលាយក្នុងទឹក ហើយអាចស្ថិតនៅក្នុងដំណាក់កាលទឹកជាមួយនឹង RNA ដើម្បីជួយដល់ការធ្លាក់ភ្លៀងជាបន្តបន្ទាប់។កំហាប់នៃ glycogen ដោយគ្មាន RNase ដែលបានណែនាំគឺ 250μg/ml សម្រាប់គំរូតិចជាង 50mg នៃជាលិកា ឬ 106 កោសិកាវប្បធម៌។

ការបន្ថែម BSA acetylated ទៅនឹងប្រតិកម្មប្រតិចារឹកបញ្ច្រាសដោយប្រើ SuperScriptⅡ អាចបង្កើនភាពប្រែប្រួល ហើយសម្រាប់ RNA មួយចំនួនតូច កាត់បន្ថយបរិមាណ SuperScriptⅡ និងការបន្ថែម 40 ឯកតានៃ RnaseOut nuclease inhibitor អាចធ្វើអោយកម្រិតការរកឃើញកាន់តែប្រសើរឡើង។ប្រសិនបើ glycogen ត្រូវបានប្រើនៅក្នុងការបំបែក RNA ការបន្ថែម BSA ឬ RNase inhibitors ដើម្បីបញ្ច្រាសប្រតិកម្មប្រតិចារិកដោយប្រើ SuperScriptⅡ នៅតែត្រូវបានណែនាំ។

Ⅱ. បង្កើនភាពជាក់លាក់នៃ RT-PCR

1. ការសំយោគ cNDA៖

វិធីសាស្រ្តបីផ្សេងគ្នាអាចត្រូវបានប្រើដើម្បីផ្តួចផ្តើមការសំយោគ cDNA strand ដំបូង ហើយភាពជាក់លាក់ដែលទាក់ទងនៃវិធីសាស្រ្តនីមួយៗប៉ះពាល់ដល់បរិមាណ និងប្រភេទនៃ cDNA សំយោគ។

វិធីសាស្ត្រ primer ចៃដន្យគឺជាក់លាក់តិចបំផុតក្នុងចំណោមវិធីសាស្រ្តទាំងបី។ថ្នាំ primers ត្រូវបាន annealed នៅកន្លែងជាច្រើននៅទូទាំង transcript ដើម្បីបង្កើត cDNA ខ្លីមួយផ្នែក។វិធីសាស្រ្តនេះត្រូវបានគេប្រើជាញឹកញាប់ដើម្បីទទួលបាន 5′ លំដាប់ស្ថានីយ និង cDNA ពីគំរូ RNA ជាមួយនឹងតំបន់រចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំ ឬជាមួយគេហទំព័របញ្ចប់ដែលបញ្ច្រាស transcriptase មិនអាចចម្លងបាន។ដើម្បីទទួលបាន cDNA ដ៏វែងបំផុត សមាមាត្រនៃ primers ទៅ RNA នៅក្នុងគំរូ RNA នីមួយៗចាំបាច់ត្រូវកំណត់ជាក់ស្តែង។កំហាប់ដំបូងនៃ primers ចៃដន្យមានចាប់ពី 50 ទៅ 250ng ក្នុងមួយប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម20μl។ដោយសារតែ cDNA ដែលត្រូវបានសំយោគពី RNA សរុបដោយប្រើ primers ចៃដន្យគឺជា RNA ជាចម្បង ribosomal, poly(A) + RNA ជាទូទៅត្រូវបានជ្រើសរើសជាគំរូ។

ការចាប់ផ្តើម Oligo (dT) គឺជាក់លាក់ជាង primers ចៃដន្យ។វាបង្កាត់ជាមួយកន្ទុយ poly(A) ដែលបានរកឃើញនៅចុង 3′ នៃ mRNA នៅក្នុងកោសិកា eukaryotic ភាគច្រើន។ដោយសារតែ poly(A) + RNA គឺប្រហែល 1% ទៅ 2% នៃ RNA សរុប បរិមាណ និងភាពស្មុគស្មាញនៃ cDNA គឺតិចជាងច្រើនប្រសិនបើ primers ចៃដន្យត្រូវបានប្រើ។ដោយសារតែភាពជាក់លាក់ខ្ពស់របស់វា oligo(dT) ជាទូទៅមិនតម្រូវឱ្យមានការបង្កើនប្រសិទ្ធភាពសម្រាប់ RNA ទៅសមាមាត្រ primer និងការជ្រើសរើស poly(A)+ ទេ។វាត្រូវបានណែនាំឱ្យប្រើ 0.5μg oligo(dT) ក្នុងមួយប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម20μl។oligo(dT)12-18 គឺសមរម្យសម្រាប់ RT-PCR ភាគច្រើន។ប្រព័ន្ធ ThermoScript RT-PCR ផ្តល់នូវ oligo(dT)20 ដោយសារតែស្ថេរភាពកម្ដៅដ៏ល្អរបស់វា និងសមរម្យសម្រាប់សីតុណ្ហភាពកាន់ខ្ពស់ជាងនេះ។

ថ្នាំ primers ជាក់លាក់នៃហ្សែន (GSP) គឺជា primers ជាក់លាក់ដ៏ល្អបំផុតសម្រាប់ជំហានចម្លងបញ្ច្រាស។GSP គឺជាសារធាតុប្រឆាំងអុកស៊ីតកម្ម oligonucleoside ដែលអាចបង្រួបបង្រួមយ៉ាងជាក់លាក់ជាមួយនឹងលំដាប់ទិសដៅ RNA ជាជាងការបញ្ចូល Rnas ទាំងអស់ដូចជា primers ចៃដន្យ ឬ oligo (dT) ។ច្បាប់ដែលប្រើដើម្បីរចនា PCR primers ក៏អនុវត្តចំពោះការរចនានៃប្រតិកម្មប្រតិចារិកបញ្ច្រាស GSP ផងដែរ។GSP អាចជាលំដាប់ដូចគ្នានឹង amplification primer ដែលត្រូវបាន annealed នៅចុងបញ្ចប់នៃ mRNA3′ ឬ GSP អាចត្រូវបានរចនាឡើងដើម្បីត្រូវបាន annealed ខាងក្រោមជាមួយនឹង primer amplification បញ្ច្រាស។សម្រាប់វត្ថុពង្រីកមួយចំនួន ចាំបាច់ត្រូវរចនា primer antisense ច្រើនជាងមួយសម្រាប់ RT-PCR ជោគជ័យ ព្រោះរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំនៃ RNA គោលដៅអាចការពារ primer ពីការចង។វាត្រូវបានស្នើឱ្យប្រើ 1pmol antisense GSP នៅក្នុងប្រព័ន្ធប្រតិកម្មសំយោគខ្សែសង្វាក់ទីមួយនៃ20μl។

2. បង្កើនសីតុណ្ហភាពរក្សាកំដៅនៃការចម្លងបញ្ច្រាស៖

ដើម្បីទទួលបានអត្ថប្រយោជន៍ពេញលេញពីភាពជាក់លាក់របស់ GSP ការប្រើបញ្ច្រាស transcriptase ដែលមានស្ថេរភាពកម្ដៅខ្ពស់គួរតែត្រូវបានប្រើ។ត្រានស្គ្រីបបញ្ច្រាសដែលមានស្ថេរភាពកំដៅអាចត្រូវបានអ៊ីសូឡង់នៅសីតុណ្ហភាពខ្ពស់ដើម្បីបង្កើនភាពរឹងនៃប្រតិកម្ម។ឧទាហរណ៍ ប្រសិនបើ GSP ត្រូវបាន annealed នៅ 55 ° C នោះភាពជាក់លាក់នៃ GSP មិនត្រូវបានប្រើប្រាស់ពេញលេញទេ ប្រសិនបើការចម្លងបញ្ច្រាសត្រូវបានអនុវត្តនៅ 37 ° C ជាមួយនឹងភាពតឹងរ៉ឹងទាបដោយប្រើ AMV ឬ M-MLV ។ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយ SuperScripⅡ និង ThermoScript អាចប្រតិកម្មនៅ 50 ℃ ឬខ្ពស់ជាងនេះ ដែលលុបបំបាត់ផលិតផលដែលមិនជាក់លាក់ដែលផលិតនៅសីតុណ្ហភាពទាប។សម្រាប់ភាពជាក់លាក់អតិបរមា ល្បាយ RNA/ primer អាចត្រូវបានផ្ទេរដោយផ្ទាល់ពីសីតុណ្ហភាព denaturation 65 ℃ ទៅសីតុណ្ហភាពរក្សាប្រតិចារិកបញ្ច្រាសជាមួយនឹងការបន្ថែមនៃល្បាយប្រតិកម្ម 2 x preheated (ការចាប់ផ្តើមកំដៅនៃការសំយោគ cDNA) ។វាជួយការពារការផ្គូផ្គងមូលដ្ឋានរវាងម៉ូលេគុលនៅសីតុណ្ហភាពទាប។ការប្រើប្រាស់ឧបករណ៍ PCR ជួយសម្រួលដល់ការផ្លាស់ប្តូរសីតុណ្ហភាពជាច្រើនដែលត្រូវការសម្រាប់ RT-PCR ។

3. កាត់បន្ថយការចម្លងរោគ DNA ហ្សែន៖

ការលំបាកសក្តានុពលមួយជាមួយ RT-PCR គឺថា RNA បំពុល DNA ហ្សែន។ការប្រើប្រាស់វិធីសាស្ត្របំបែក RNA កាន់តែប្រសើរ ដូចជា Trizol Reagent កាត់បន្ថយការចម្លងរោគ DNA ហ្សែនក្នុងការត្រៀម RNA ។ដើម្បីជៀសវាងផលិតផលដែលផលិតចេញពី DNA ហ្សែន RNA អាចត្រូវបានព្យាបាលដោយការពង្រីកកម្រិត DnasⅠ ដើម្បីលុប DNA ដែលកខ្វក់មុនពេលធ្វើប្រតិចារិកបញ្ច្រាស។សំណាកត្រូវបានរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាព 65 ℃ក្នុង 2.0mM EDTA រយៈពេល 10 នាទីដើម្បីបញ្ចប់ការរំលាយអាហារ DNaseⅠ។EDTA chelates អ៊ីយ៉ុងម៉ាញេស្យូមដើម្បីការពារអ៊ីយ៉ុងម៉ាញ៉េស្យូមដែលពឹងផ្អែកលើ RNA hydrolysis ដែលកើតឡើងនៅសីតុណ្ហភាពខ្ពស់។

ដើម្បីបំបែក cDNA ដែលត្រូវបានពង្រីកពីផលិតផលពង្រីក DNA ហ្សែន សារធាតុ primers ដែល anneal ដាច់ដោយឡែកជាមួយ exon ដាច់ដោយឡែកអាចត្រូវបានរចនា។ផលិតផល PCR ដែលទទួលបានពី cDNA នឹងមានរយៈពេលខ្លីជាងផលិតផលដែលបានមកពី DNA ហ្សែនកខ្វក់។ការពិសោធន៍ដែលបានគ្រប់គ្រងដោយគ្មានការចម្លងបញ្ច្រាសក៏ត្រូវបានអនុវត្តនៅលើគំរូ RNA នីមួយៗដើម្បីកំណត់ថាតើបំណែកដែលបានផ្តល់ឱ្យគឺមកពី DNA ឬ cDNA ហ្សែន។ផលិតផល PCR ដែលទទួលបាននៅក្នុងការអវត្ដមាននៃការចម្លងបញ្ច្រាសគឺបានមកពីហ្សែន។

ផលិតផលដែលពាក់ព័ន្ធ

RT-PCR ងាយស្រួល^ᵀᴹខ្ញុំ (ជំហានមួយ)

- ឧបករណ៍មួយជំហានអាចឱ្យការចម្លងបញ្ច្រាស និង PCR ត្រូវបានអនុវត្តនៅក្នុងបំពង់តែមួយ។វាគ្រាន់តែត្រូវការបន្ថែមគំរូ RNA, primers PCR ជាក់លាក់ និង RNase-Free ddH ប៉ុណ្ណោះ។₂O.

- ការវិភាគបរិមាណពេលវេលាពិតនៃ RNA អាចត្រូវបានអនុវត្តយ៉ាងឆាប់រហ័ស និងត្រឹមត្រូវ។

- កញ្ចប់ប្រើប្រាស់សារធាតុចម្លងបញ្ច្រាស Foregene តែមួយគត់ និង Foregene HotStar Taq DNA Polymerase រួមបញ្ចូលគ្នាជាមួយប្រព័ន្ធប្រតិកម្មពិសេសមួយ ដើម្បីបង្កើនប្រសិទ្ធភាពបង្កើនប្រសិទ្ធភាព និងភាពជាក់លាក់នៃប្រតិកម្ម។

- ប្រព័ន្ធប្រតិកម្មដែលប្រសើរឡើងធ្វើឱ្យប្រតិកម្មមានភាពរសើបក្នុងការរកឃើញខ្ពស់ ស្ថេរភាពកម្ដៅខ្លាំងជាងមុន និងមានភាពអត់ធ្មត់កាន់តែប្រសើរ។

RT Easy II (ជាមួយ GDNase) Master Premix សម្រាប់ការសំយោគ CDNA ដំបូងសម្រាប់ PCR ពេលវេលាពិតជាមួយ GDNase

សមត្ថភាព​យ៉ាង​មាន​ប្រសិទ្ធភាព​ក្នុង​ការ​លុប gDNA ដែល​អាច​យក gDNA ក្នុង​ពុម្ព​ចេញ​ក្នុង​រយៈ​ពេល ២ នាទី​។

- ប្រព័ន្ធប្រតិចារឹកបញ្ច្រាសប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាព វាចំណាយពេលត្រឹមតែ 15 នាទីដើម្បីបញ្ចប់ការសំយោគនៃ cDNA ខ្សែទីមួយ។

គំរូស្មុគ្រស្មាញ៖ គំរូដែលមានមាតិកា GC ខ្ពស់ និងរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំស្មុគ្រស្មាញក៏អាចត្រលប់មកវិញជាមួយនឹងប្រសិទ្ធភាពខ្ពស់។

-ប្រព័ន្ធប្រតិចារឹកបញ្ច្រាសដែលមានភាពប្រែប្រួលខ្ពស់ គំរូកម្រិត pg ក៏អាចទទួលបាន cDNA ដែលមានគុណភាពខ្ពស់ផងដែរ។

- ប្រព័ន្ធប្រតិចារឹកបញ្ច្រាសមានស្ថេរភាពកំដៅខ្ពស់ សីតុណ្ហភាពប្រតិកម្មល្អបំផុតគឺ 42 ℃ ហើយវានៅតែមានដំណើរការប្រតិចារិកបញ្ច្រាសដ៏ល្អនៅ 50 ℃។