ទិដ្ឋភាពទូទៅ
ការកំណត់អត្តសញ្ញាណយ៉ាងឆាប់រហ័សនៃរុក្ខជាតិប្តូរហ្សែន
អត្ថបទ/Tong Yucheng
ប្រតិបត្តិការពិសោធន៍ / ហានយីង
កម្មវិធីនិពន្ធ/Wen Youjun
ពាក្យ / 1600+
ពេលវេលាអានដែលបានណែនាំ / 8-10 នាទី។
ការកំណត់អត្តសញ្ញាណយ៉ាងឆាប់រហ័សនៃរុក្ខជាតិប្តូរហ្សែន
ក្នុងនាមជាអ្នកចំណូលថ្មីនៅក្នុងមន្ទីរពិសោធន៍ វាមិនមែនជាការងារល្អទេក្នុងការពិនិត្យមើលរុក្ខជាតិវិជ្ជមានពីក្រុមរុក្ខជាតិដែលមានអត្រាបំប្លែងទាប។ទីមួយ DNA ត្រូវតែត្រូវបានស្រង់ចេញពីគំរូមួយចំនួនធំម្តងមួយៗ ហើយបន្ទាប់មកហ្សែនបរទេសនឹងត្រូវបានរកឃើញដោយ PCR ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ លទ្ធផលតែងតែមានចន្លោះទទេ និងមានធាតុមួយចំនួនម្តងម្កាល ប៉ុន្តែវាមិនអាចកំណត់ថាតើមានការខកខានក្នុងការរកឃើញ ឬការរកឃើញមិនពិតនោះទេ។.តើវាគ្មានជំនួយទេក្នុងការប្រឈមមុខនឹងដំណើរការពិសោធន៍ និងលទ្ធផលបែបនេះ?កុំបារម្ភ បងប្រុសបង្រៀនអ្នកពីរបៀបពិនិត្យរុក្ខជាតិវិជ្ជមានឆ្លងហ្សែនយ៉ាងងាយស្រួល និងត្រឹមត្រូវ។
ជំហានទី 1: ការរចនាឧបករណ៍ចាប់សញ្ញាបឋម
កំណត់ហ្សែន endogenous និង exogenous ហ្សែនដែលត្រូវបានរកឃើញយោងទៅតាមគំរូដែលត្រូវធ្វើតេស្ត ហើយជ្រើសរើសតំណាង 100-500bp លំដាប់នៅក្នុងហ្សែនសម្រាប់ការរចនាបឋម។ថ្នាំ primers ល្អអាចធានាបាននូវភាពត្រឹមត្រូវនៃលទ្ធផលរាវរក និងកាត់បន្ថយពេលវេលារាវរក (សូមមើលឧបសម្ព័ន្ធសម្រាប់ primer រាវរកដែលប្រើជាទូទៅ)។
ចំណាំ៖
ថ្នាំ primers ដែលទើបនឹងរចនាថ្មីត្រូវការបង្កើនប្រសិទ្ធភាពលក្ខខណ្ឌប្រតិកម្ម និងផ្ទៀងផ្ទាត់ភាពត្រឹមត្រូវ ភាពជាក់លាក់ និងដែនកំណត់នៃការរកឃើញនៃការរាវរក មុនពេលអនុវត្តការរកឃើញទ្រង់ទ្រាយធំ។
ជំហានទី 2៖បង្កើតពិធីការពិសោធន៍
ការគ្រប់គ្រងវិជ្ជមាន៖ ប្រើ DNA បន្សុតដែលមានបំណែកគោលដៅជាគំរូដើម្បីកំណត់ថាតើប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម PCR និងលក្ខខណ្ឌគឺធម្មតា។
ការត្រួតពិនិត្យអវិជ្ជមាន/ទទេ៖ ប្រើគំរូ DNA ឬ ddH2O ដែលមិនមានបំណែកគោលដៅជាគំរូដើម្បីរកមើលថាតើមានប្រភពនៃការចម្លងរោគនៅក្នុងប្រព័ន្ធ PCR ដែរឬទេ។
ការត្រួតពិនិត្យឯកសារយោងខាងក្នុង៖ ប្រើការផ្សំបឋម/ការស៊ើបអង្កេតនៃហ្សែន endogenous នៃគំរូដែលត្រូវធ្វើតេស្តដើម្បីវាយតម្លៃថាតើគំរូអាចត្រូវបានរកឃើញដោយ PCR ដែរឬទេ។
ចំណាំ៖
ការត្រួតពិនិត្យវិជ្ជមាន អវិជ្ជមាន/ទទេ និងការត្រួតពិនិត្យផ្ទៃក្នុងគួរតែត្រូវបានកំណត់សម្រាប់ការធ្វើតេស្តនីមួយៗ ដើម្បីវាយតម្លៃសុពលភាពនៃលទ្ធផលពិសោធន៍។
ជំហានទី 3៖ ការរៀបចំពិសោធន៍
មុនពេលប្រើសូមសង្កេតមើលថាតើដំណោះស្រាយត្រូវបានលាយបញ្ចូលគ្នាស្មើៗគ្នាដែរឬទេ។ប្រសិនបើរកឃើញទឹកភ្លៀង វាត្រូវរំលាយ និងលាយតាមការណែនាំមុននឹងប្រើ។ល្បាយ 2 × PCR ចាំបាច់ត្រូវដាក់បំពង់ និងលាយម្តងហើយម្តងទៀតជាមួយ micropipette មុនពេលប្រើ ដើម្បីជៀសវាងការចែកចាយអ៊ីយ៉ុងមិនស្មើគ្នា។
ចំណាំ៖
យកការណែនាំចេញ ហើយអានដោយប្រុងប្រយ័ត្ន ហើយរៀបចំមុនពេលពិសោធន៍ដោយអនុលោមតាមការណែនាំយ៉ាងតឹងរ៉ឹង។
ជំហានទី 4: រៀបចំប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម PCR
យោងតាមពិធីការពិសោធន៍ លាយ primers, H2O, 2 × PCR លាយ, centrifuge និងចែកចាយពួកវាទៅបំពង់ប្រតិកម្មនីមួយៗ។
ចំណាំ៖
សម្រាប់ការធ្វើតេស្តខ្នាតធំ ឬរយៈពេលវែង វាត្រូវបានណែនាំអោយប្រើប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម PCR ដែលមានអង់ស៊ីម UNG ដែលអាចជៀសវាងការចម្លងរោគ aerosol ដែលបណ្តាលមកពីផលិតផល PCR ។
ជំហានទី 5: បន្ថែមគំរូប្រតិកម្ម
ដោយប្រើបច្ចេកវិទ្យា Direct PCR មិនចាំបាច់មានដំណើរការបន្សុតអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីកដ៏ធុញទ្រាន់នោះទេ។គំរូគំរូអាចត្រូវបានរៀបចំក្នុងរយៈពេល 10 នាទី និងបន្ថែមទៅប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម PCR ដែលត្រូវគ្នា។
ចំណាំ៖
វិធីសាស្ត្រ Lysis មានប្រសិទ្ធិភាពក្នុងការរកឃើញបានល្អប្រសើរ ហើយផលិតផលដែលទទួលបានអាចត្រូវបានប្រើសម្រាប់ប្រតិកម្មរាវរកច្រើន។
5.1: PCR ផ្ទាល់នៃស្លឹក
យោងតាមទំហំនៃរូបភាពនៅក្នុងសៀវភៅដៃកាត់ក្រដាសស្លឹកដែលមានអង្កត់ផ្ចិត 2-3 មីលីម៉ែត្រហើយដាក់វានៅក្នុងប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម PCR ។
ចំណាំ៖ ត្រូវប្រាកដថាបំណែកស្លឹកត្រូវបានជ្រមុជទាំងស្រុងនៅក្នុងដំណោះស្រាយប្រតិកម្ម PCR ហើយកុំបន្ថែមជាលិកាស្លឹកច្រើនពេក។
5.2: វិធីសាស្រ្តលីហ្សីស្លឹក
កាត់ជាលិកាស្លឹកដែលមានអង្កត់ផ្ចិត 5-7mm ហើយដាក់វានៅក្នុងបំពង់ centrifuge ។ប្រសិនបើអ្នកជ្រើសរើសស្លឹកចាស់ សូមជៀសវាងការប្រើជាលិកានៃសរសៃសំខាន់នៃស្លឹក។Pipette 50ul Buffer P1 lysate ចូលទៅក្នុងបំពង់ centrifuge ដើម្បីធានាថា lysate អាចពន្លិចជាលិកាស្លឹកទាំងស្រុង ដាក់វានៅក្នុងម៉ាស៊ីនកំដៅ ឬអាងងូតទឹកដែក ហើយ lyse នៅសីតុណ្ហភាព 95°C រយៈពេល 5-10 នាទី។
បន្ថែមដំណោះស្រាយអព្យាក្រឹត Buffer P2 50ul និងលាយល្អ។lysate លទ្ធផលអាចត្រូវបានប្រើជាគំរូមួយនិងបន្ថែមទៅប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម PCR ។
ចំណាំ៖ បរិមាណនៃគំរូគួរតែមានចន្លោះពី 5-10% នៃប្រព័ន្ធ PCR ហើយមិនគួរលើសពី 20% (ឧទាហរណ៍ក្នុងប្រព័ន្ធ PCR 20μl បន្ថែម 1-2μl នៃ lysis buffer មិនលើសពី 4μl)។
ជំហានទី 6: ប្រតិកម្ម PCR
បនា្ទាប់ពីបញ្ចោញបំពង់ប្រតិកម្ម PCR សូមដាក់វានៅក្នុងឧបករណ៍ PCR សម្រាប់ការពង្រីក។
ចំណាំ៖
ប្រតិកម្មប្រើគំរូដែលមិនបន្សុតសម្រាប់ការពង្រីក ដូច្នេះចំនួននៃវដ្ដ amplification គឺ 5-10 វដ្តច្រើនជាងពេលប្រើគំរូ DNA បន្សុត។
ជំហានទី 7: ការរកឃើញ electrophoresis និងការវិភាគលទ្ធផល
M: 100bp DNA Ladder
1\ 4៖ វិធីសាស្ត្រ DNA បន្សុត
2\5៖ វិធីសាស្ត្រ PCR ផ្ទាល់
3\6: ការគ្រប់គ្រងទទេ
ការត្រួតពិនិត្យគុណភាព៖
លទ្ធផលតេស្តនៃវត្ថុបញ្ជាផ្សេងៗដែលបានកំណត់នៅក្នុងការពិសោធន៍គួរតែបំពេញលក្ខខណ្ឌដូចខាងក្រោម។បើមិនដូច្នោះទេមូលហេតុនៃបញ្ហាគួរតែត្រូវបានវិភាគហើយការធ្វើតេស្តគួរតែត្រូវបានអនុវត្តម្តងទៀតបន្ទាប់ពីបញ្ហាត្រូវបានលុបចោល។
តារាងទី 1. លទ្ធផលតេស្តធម្មតានៃក្រុមត្រួតពិនិត្យផ្សេងៗ
* នៅពេលដែល plasmid ត្រូវបានប្រើជាការត្រួតពិនិត្យវិជ្ជមាន លទ្ធផលតេស្តហ្សែន endogenous អាចអវិជ្ជមាន
ការវិនិច្ឆ័យលទ្ធផល៖
A. លទ្ធផលតេស្តនៃហ្សែន endogenous នៃសំណាកគឺអវិជ្ជមាន ដែលបង្ហាញថា DNA ដែលសមរម្យសម្រាប់ការរកឃើញ PCR ធម្មតាមិនអាចស្រង់ចេញពីសំណាកគំរូ ឬ DNA ដែលបានស្រង់ចេញមានសារធាតុរារាំងប្រតិកម្ម PCR ហើយ DNA គួរតែត្រូវបានស្រង់ចេញម្តងទៀត។
ខ. លទ្ធផលតេស្តនៃហ្សែន endogenous នៃសំណាកគឺវិជ្ជមាន ហើយលទ្ធផលតេស្តនៃហ្សែន exogenous គឺអវិជ្ជមាន ដែលបង្ហាញថា DNA ដែលសមស្របសម្រាប់ការរកឃើញ PCR ធម្មតាត្រូវបានស្រង់ចេញពីគំរូ ហើយវាអាចត្រូវបានវិនិច្ឆ័យថាហ្សែន XXX មិនត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងគំរូនោះទេ។
គ. លទ្ធផលតេស្តនៃហ្សែន endogenous នៃសំណាកគឺវិជ្ជមាន ហើយលទ្ធផលតេស្តនៃហ្សែន exogenous គឺវិជ្ជមាន ដែលបង្ហាញថា DNA ដែលសមស្របសម្រាប់ការរកឃើញ PCR ធម្មតាត្រូវបានស្រង់ចេញពីគំរូ ហើយ DNA គំរូមានហ្សែន XXX ។ការពិសោធន៍បញ្ជាក់អាចត្រូវបានអនុវត្តបន្ថែមទៀត។
ជំហានទី 8: ការរចនា primer រាវរក
បន្ទាប់ពីការពិសោធន៍ ប្រើដំណោះស្រាយសូដ្យូមអ៊ីប៉ូក្លរីត 2% និងដំណោះស្រាយអេតាណុល 70% ដើម្បីជូតកន្លែងពិសោធន៍ដើម្បីការពារការបំពុលបរិស្ថាន។
ឧបសម្ព័ន្ធ
តារាង 2. ថ្នាំ primers ដែលប្រើជាទូទៅសម្រាប់ការរកឃើញ PCR ទូទៅនៃរុក្ខជាតិដែលបានកែប្រែហ្សែន
ឯកសារយោង៖
SN/T 1202-2010, វិធីសាស្ត្ររកឃើញ PCR គុណភាពសម្រាប់ធាតុផ្សំរុក្ខជាតិដែលបានកែប្រែហ្សែននៅក្នុងអាហារ។
សេចក្តីជូនដំណឹងរបស់ក្រសួងកសិកម្ម ១៤៨៥-៥-២០១០ ការធ្វើតេស្តធាតុផ្សំនៃរុក្ខជាតិកែប្រែហ្សែន និងផលិតផលរបស់វា-អង្ករ M12 និងនិស្សន្ទវត្ថុរបស់វា។
ពេលវេលាផ្សាយ៖ មិថុនា-០៩-២០២១
