ក្នុងនាមជាថ្មីមួយនៅក្នុងមន្ទីរពិសោធន៍ វាមិនមែនជាការងារល្អទេក្នុងការពិនិត្យមើលរុក្ខជាតិវិជ្ជមានពីក្រុមរុក្ខជាតិដែលមានអត្រាបំប្លែងទាប។ទីមួយ DNA ត្រូវតែត្រូវបានស្រង់ចេញពីគំរូមួយចំនួនធំម្តងមួយៗ ហើយបន្ទាប់មកហ្សែនបរទេសនឹងត្រូវបានរកឃើញដោយ PCR ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ លទ្ធផលតែងតែមានចន្លោះទទេ និងមានធាតុមួយចំនួនម្តងម្កាល ប៉ុន្តែវាមិនអាចកំណត់ថាតើមានការខកខានក្នុងការរកឃើញ ឬការរកឃើញមិនពិតនោះទេ។.តើវាគ្មានជំនួយទេក្នុងការប្រឈមមុខនឹងដំណើរការពិសោធន៍ និងលទ្ធផលបែបនេះ?កុំបារម្ភ បងប្រុសបង្រៀនអ្នកពីរបៀបពិនិត្យរុក្ខជាតិវិជ្ជមានឆ្លងហ្សែនយ៉ាងងាយស្រួល និងត្រឹមត្រូវ។

ជំហានទី 1

ការរចនាឧបករណ៍ចាប់សញ្ញាបឋម

កំណត់ហ្សែន endogenous និង exogenous ហ្សែនដែលត្រូវបានរកឃើញយោងទៅតាមគំរូដែលត្រូវធ្វើតេស្ត ហើយជ្រើសរើសតំណាង 100-500bp លំដាប់នៅក្នុងហ្សែនសម្រាប់ការរចនាបឋម។ថ្នាំ primers ល្អអាចធានាបាននូវភាពត្រឹមត្រូវនៃលទ្ធផលរាវរក និងកាត់បន្ថយពេលវេលារាវរក (សូមមើលឧបសម្ព័ន្ធសម្រាប់ primer រាវរកដែលប្រើជាទូទៅ)។

សេចក្តីជូនដំណឹង៖ ថ្នាំ primers ដែលទើបនឹងរចនាថ្មី ត្រូវការបង្កើនប្រសិទ្ធភាពលក្ខខណ្ឌប្រតិកម្ម និងផ្ទៀងផ្ទាត់ភាពត្រឹមត្រូវ ភាពជាក់លាក់ និងដែនកំណត់នៃការរកឃើញនៃការរាវរក មុនពេលការរកឃើញទ្រង់ទ្រាយធំ។

ជំហានទី 2

រចនាពិធីការពិសោធន៍

ការគ្រប់គ្រងវិជ្ជមាន៖ ប្រើ DNA បន្សុតដែលមានបំណែកគោលដៅជាគំរូដើម្បីកំណត់ថាតើប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម PCR និងលក្ខខណ្ឌគឺធម្មតា។

ការត្រួតពិនិត្យអវិជ្ជមាន/ទទេ៖ ប្រើគំរូ DNA ឬ ddH2O ដែលមិនមានបំណែកគោលដៅជាគំរូ ដើម្បីរកមើលថាតើមានប្រភពនៃការចម្លងរោគនៅក្នុងប្រព័ន្ធ PCR ដែរឬទេ។

ការត្រួតពិនិត្យឯកសារយោងខាងក្នុង៖ ប្រើការផ្សំបឋម/ការស៊ើបអង្កេតនៃហ្សែន endogenous នៃគំរូដែលត្រូវធ្វើតេស្តដើម្បីវាយតម្លៃថាតើគំរូអាចត្រូវបានរកឃើញដោយ PCR ដែរឬទេ។

សេចក្តីជូនដំណឹង៖

ការត្រួតពិនិត្យវិជ្ជមាន អវិជ្ជមាន/ទទេ និងការត្រួតពិនិត្យផ្ទៃក្នុងគួរតែត្រូវបានកំណត់សម្រាប់ការធ្វើតេស្តនីមួយៗ ដើម្បីវាយតម្លៃសុពលភាពនៃលទ្ធផលពិសោធន៍។

ការរៀបចំពិសោធន៍

មុនពេលប្រើសូមសង្កេតមើលថាតើដំណោះស្រាយត្រូវបានលាយបញ្ចូលគ្នាស្មើៗគ្នាដែរឬទេ។ប្រសិនបើ​រក​ឃើញ​ទឹកភ្លៀង វា​ត្រូវ​រំលាយ និង​លាយ​តាម​ការណែនាំ​មុន​នឹង​ប្រើ​។ល្បាយ 2 × PCR ចាំបាច់ត្រូវដាក់បំពង់ និងលាយម្តងហើយម្តងទៀតជាមួយ micropipette មុនពេលប្រើ ដើម្បីជៀសវាងការចែកចាយអ៊ីយ៉ុងមិនស្មើគ្នា។

សេចក្តីជូនដំណឹង៖

យកសៀវភៅដៃចេញ ហើយអានដោយប្រុងប្រយ័ត្ន ហើយរៀបចំមុនពេលពិសោធន៍ដោយអនុលោមតាមតម្រូវការនៃសៀវភៅណែនាំ។

ជំហានទី 4

រៀបចំប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម PCR

យោងតាមពិធីការពិសោធន៍ លាយថ្នាំ primers, H2O, និង 2 × PCR លាយឱ្យស្មើគ្នា ផ្ចិត និងចែកចាយពួកវាទៅបំពង់ប្រតិកម្មនីមួយៗ។

សេចក្តីជូនដំណឹង៖

សម្រាប់ការធ្វើតេស្តខ្នាតធំ ឬរយៈពេលវែង វាត្រូវបានណែនាំអោយប្រើប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម PCR ដែលមានអង់ស៊ីម UNG ដែលអាចជៀសវាងការចម្លងរោគ aerosol ដែលបណ្តាលមកពីផលិតផល PCR ។

ជំហានទី 5

បន្ថែមគំរូប្រតិកម្ម

ដោយប្រើបច្ចេកវិទ្យា Direct PCR មិនចាំបាច់មានដំណើរការបន្សុតអាស៊ីត nucleic គួរឱ្យធុញទ្រាន់ទេ គំរូគំរូអាចត្រូវបានរៀបចំក្នុងរយៈពេល 10 នាទី ហើយប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម PCR ដែលត្រូវគ្នាអាចត្រូវបានបន្ថែម។

សេចក្តីជូនដំណឹង៖

វិធីសាស្ត្របំបែកមានប្រសិទ្ធិភាពក្នុងការរកឃើញកាន់តែប្រសើរ ហើយផលិតផលដែលទទួលបានអាចត្រូវបានប្រើសម្រាប់ប្រតិកម្មរាវរកច្រើន។

5.1: ការពង្រីកស្លឹកដោយផ្ទាល់

យោងតាមទំហំនៃរូបភាពនៅក្នុងសៀវភៅដៃកាត់ក្រដាសស្លឹកដែលមានអង្កត់ផ្ចិត 2-3 មីលីម៉ែត្រហើយដាក់វានៅក្នុងប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម PCR ។

ចំណាំ៖ ត្រូវប្រាកដថាបំណែកស្លឹកត្រូវបានជ្រមុជទាំងស្រុងនៅក្នុងដំណោះស្រាយប្រតិកម្ម PCR ហើយកុំបន្ថែមជាលិកាស្លឹកច្រើនពេក។

៥.២៖ វិធីសាស្ត្របំបែកស្លឹក

កាត់ជាលិកាស្លឹកដែលមានអង្កត់ផ្ចិត 5-7mm ហើយដាក់វានៅក្នុងបំពង់ centrifuge ។ប្រសិនបើអ្នកជ្រើសរើសស្លឹកចាស់ សូមជៀសវាងការប្រើជាលិកានៃសរសៃសំខាន់នៃស្លឹក។Pipette 50ul Buffer P1 lysate ចូលទៅក្នុងបំពង់ centrifuge ដើម្បីធានាថា lysate អាចពន្លិចជាលិកាស្លឹកទាំងស្រុង ដាក់វានៅក្នុងម៉ាស៊ីនកំដៅ ឬអាងងូតទឹកដែក ហើយ lyse នៅសីតុណ្ហភាព 95°C រយៈពេល 5-10 នាទី។

បន្ថែមដំណោះស្រាយអព្យាក្រឹត Buffer P2 50ul និងលាយល្អ។lysate លទ្ធផលអាចត្រូវបានប្រើជាគំរូមួយនិងបន្ថែមទៅប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម PCR ។

ចំណាំ៖ បរិមាណនៃគំរូគឺស្ថិតនៅចន្លោះពី 5-10% នៃប្រព័ន្ធ PCR ហើយមិនគួរលើសពី 20% (ឧទាហរណ៍ក្នុងប្រព័ន្ធ PCR 20μl បន្ថែម 1-2μl នៃដំណោះស្រាយលីលីស មិនលើសពី 4μl)។

ជំហានទី 6

ប្រតិកម្ម PCR

បន្ទាប់ពី centrifuging បំពង់ប្រតិកម្ម PCR វាត្រូវបានដាក់ក្នុងឧបករណ៍ PCR សម្រាប់ការពង្រីក។

សេចក្តីជូនដំណឹង៖

ប្រតិកម្មប្រើគំរូដែលមិនបន្សុតសម្រាប់ការពង្រីក ដូច្នេះចំនួននៃវដ្ដ amplification គឺ 5-10 វដ្តច្រើនជាងពេលប្រើគំរូ DNA បន្សុត។

ជំហានទី 7

ការរកឃើញ Electrophoresis និងការវិភាគលទ្ធផល

M: 100bp DNA Ladder

1\ 4៖ វិធីសាស្ត្រ DNA បន្សុត

2\5៖ វិធីសាស្ត្រ PCR ផ្ទាល់

3\6: ការគ្រប់គ្រងទទេ

QC៖

លទ្ធផលនៃការធ្វើតេស្តនៃការត្រួតពិនិត្យផ្សេងៗដែលបានកំណត់នៅក្នុងការពិសោធន៍គួរតែបំពេញតាមលក្ខខណ្ឌដូចខាងក្រោម។បើមិនដូច្នោះទេមូលហេតុនៃបញ្ហាគួរតែត្រូវបានវិភាគហើយការធ្វើតេស្តគួរតែត្រូវបានអនុវត្តម្តងទៀតបន្ទាប់ពីបញ្ហាត្រូវបានលុបចោល។

តារាងទី 1. លទ្ធផលតេស្តធម្មតានៃក្រុមត្រួតពិនិត្យផ្សេងៗ

* នៅពេលដែល plasmid ត្រូវបានប្រើជាការត្រួតពិនិត្យវិជ្ជមាន លទ្ធផលតេស្តហ្សែន endogenous អាចអវិជ្ជមាន

ការវិនិច្ឆ័យលទ្ធផល៖

A. លទ្ធផលតេស្តនៃហ្សែន endogenous នៃសំណាកគឺអវិជ្ជមាន ដែលបង្ហាញថា DNA ដែលសមរម្យសម្រាប់ការរកឃើញ PCR ធម្មតាមិនអាចស្រង់ចេញពីសំណាកគំរូ ឬ DNA ដែលបានស្រង់ចេញមានសារធាតុរារាំងប្រតិកម្ម PCR ហើយ DNA គួរតែត្រូវបានស្រង់ចេញម្តងទៀត។

ខ. លទ្ធផលតេស្តនៃហ្សែន endogenous នៃសំណាកគឺវិជ្ជមាន ហើយលទ្ធផលតេស្តនៃហ្សែន exogenous គឺអវិជ្ជមាន ដែលបង្ហាញថា DNA សមរម្យសម្រាប់ការរកឃើញ PCR ធម្មតាត្រូវបានស្រង់ចេញពីគំរូ ហើយវាអាចត្រូវបានវិនិច្ឆ័យថាហ្សែន XXX មិនត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងគំរូនោះទេ។

គ. លទ្ធផលតេស្តនៃហ្សែន endogenous នៃគំរូគឺវិជ្ជមាន ហើយលទ្ធផលតេស្តនៃហ្សែន exogenous គឺវិជ្ជមាន ដែលបង្ហាញថា DNA ដែលសមរម្យសម្រាប់ការរកឃើញ PCR ធម្មតាត្រូវបានស្រង់ចេញពីគំរូ ហើយ DNA គំរូមានហ្សែន XXX ។ការពិសោធន៍បញ្ជាក់អាចត្រូវបានអនុវត្តបន្ថែមទៀត។

ជំហានទី 8

ការរចនាឧបករណ៍ចាប់សញ្ញាបឋម

បន្ទាប់ពីការពិសោធន៍ ប្រើដំណោះស្រាយសូដ្យូមអ៊ីប៉ូក្លរីត 2% និងដំណោះស្រាយអេតាណុល 70% ដើម្បីលុបកន្លែងពិសោធន៍ ដើម្បីការពារការបំពុលបរិស្ថាន។