មនុស្សគ្រប់គ្នាកំពុងនិយាយអំពីគោលការណ៍នៃការពិសោធន៍ qRT-PCR ការរចនាបឋម ការបកស្រាយលទ្ធផល។ល។ ប៉ុន្តែខ្ញុំគិតថាខ្ញុំគួរតែចែករំលែកជាមួយអ្នកនូវប្រតិបត្តិការពិសោធន៍នៃ qRT-PCR ។វាតូចប៉ុន្តែវានិយាយអំពីលទ្ធផល។

មុនពេលធ្វើ qRT-PCR យើងត្រូវមានការយល់ដឹងច្បាស់លាស់អំពី RNA ផ្ទាល់ខ្លួនរបស់យើង និងវិធីសាស្រ្តប្រតិបត្តិការ។យ៉ាងណាមិញ ការខិតខំប្រឹងប្រែងរបស់យើងគឺសំដៅដើម្បីទទួលបានលទ្ធផល ជាជាងការអនុវត្តន៍ធម្មតា។ដូច្នេះមុននឹងធ្វើ qRT-PCR យើងត្រូវកំណត់បញ្ហាខាងក្រោម (មួយចំនួនអាចអនុវត្តបានតែចំពោះ SYBR)។

1 តើអ្នកប្រាកដថា RNA របស់អ្នកមិនត្រូវបានបន្ទាបបន្ថោកទេ?

NanoDrop 2000 អាចរកឃើញតែកំហាប់ និងភាពបរិសុទ្ធនៃ RNA ប៉ុន្តែមិនអាចរកឃើញភាពសុចរិតនៃ RNA បានទេ។

តម្លៃ RNA (RNA Intesity Number) អាចឆ្លុះបញ្ចាំងពីភាពសុចរិតនៃ RNA ដែលត្រូវបានរកឃើញដោយប្រព័ន្ធ Agilent 2100 Bioanalyzer។

រូបភាព។ ដ្យាក្រាមគ្រោងការណ៍នៃតម្លៃ RIN សម្រាប់គំរូ RNA ផ្សេងៗគ្នា (eukaryotes)

ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ មន្ទីរពិសោធន៍ជាទូទៅមិនមាន Agilent 2100 Bioanalyzer ទេ។ក្នុងករណីនេះ យើងអាចរកឃើញតាមរយៈជែល formaldehyde ប៉ុន្តែតម្រូវការសម្រាប់បរិមាណ RNA សរុបគឺខ្ពស់ ដូច្នេះវិធីសាស្ត្រលឿនបំផុតគឺប្រើ gel electrophoresis ធម្មតា។វាត្រូវបានទាមទារឱ្យស្ថិតនៅក្នុងបរិយាកាសដែលគ្មានសារធាតុនុយក្លេអ៊ែរ ដូច្នេះចាំបាច់ត្រូវលាងសម្អាតធុង electrophoresis ដបសូលុយស្យុង តង្កៀបជែល និងសិតសក់ជាមួយនឹងទឹក DEPC ។agarose ក៏គ្មានសារធាតុនុយក្លេអ៊ែរដែរ (ដរាបណាវាត្រូវបានបើកថ្មីៗ) ហើយទ្រនាប់ផ្ទុកគួរតែត្រូវបានបើកថ្មីៗតាមដែលអាចធ្វើទៅបាន ជាមួយនឹងជែល 1.2% ។

ចំណាំថាជែលត្រូវតែត្រូវបានរំលាយទាំងស្រុង បើមិនដូច្នេះទេវានឹងបណ្តាលឱ្យមានក្រុម inhomogeneous ដូចបានបង្ហាញក្នុងគំរូទី 9 នៅក្នុងរូបភាព។ប្រសិនបើវ៉ុលខ្ពស់ពេកឬដំណើរការយូរពេកនឹងបង្កើតកំដៅនិងបណ្តាលឱ្យខូច RNA ដូច្នេះវ៉ុលនិងពេលវេលាគួរតែត្រូវបានគ្រប់គ្រងដោយសមហេតុផល។លើសពីនេះ ការដំណើរការជែលក៏អាចកំណត់បន្ថែមទៀតថាតើមានសំណល់ DNA នៅក្នុងសំណាកគំរូដែរឬអត់ និងសង្កេតមើលថាតើមានក្រុមតន្រ្តីរក្សាទុកមួយចំនួនធំនៅក្នុងអណ្តូងចែកចាយដែរឬទេ។

រូប។ការរកឃើញ RNA electrophoresis ជែល

2 តើអ្នកប្រាកដអំពីការប្រមូលផ្តុំ cDNA របស់អ្នកទេ?

បទពិសោធន៍របស់បងប្អូនប្រុសធំនៅក្នុងមន្ទីរពិសោធន៍គឺថា cDNA នៃប្រព័ន្ធ 20 ul ដែលទទួលបានដោយការបញ្ច្រាស់នីមួយៗត្រូវបានពនឺដោយផ្ទាល់ 20X ខណៈពេលដែលបងប្អូនស្រីក្រោយបណ្ឌិតត្រូវបានពនរ 10X ។ជាធម្មតាខ្ញុំពឹងផ្អែកលើស្ថានភាព។ដោយសារតែគុណភាពនៃ RNA ដែលបានរៀបរាប់ដោយមនុស្សម្នាក់ៗគឺខុសគ្នា កម្រិតនៃការបញ្ច្រាសក៏ខុសគ្នាដែរ ហើយបច្ចេកវិទ្យាបញ្ច្រាសអាចមិនមានស្ថេរភាព។

ដូច្នេះរាល់ពេលដែលខ្ញុំទទួលបាន cDNA បញ្ច្រាសដំបូង ខ្ញុំនឹងពនឺវាប្រហែល 3 ដង ហើយបន្ទាប់មកប្រើហ្សែនថែរក្សាផ្ទះដើម្បីធ្វើ RT-PCR ចំនួនវដ្តជាទូទៅគឺ 25 វដ្ត ដើម្បីកំណត់ការផ្តោតអារម្មណ៍ជាក់លាក់ ហើយបន្ទាប់មកកំណត់កត្តារំលាយចុងក្រោយ។

3 តើអ្នកប្រាកដថា primers របស់អ្នកងាយស្រួលប្រើទេ?

វាអាចឆ្លងកាត់ខ្សែកោងរលាយនៃ qRT-PCR ប៉ុន្តែនេះនៅតែចំណាយប្រាក់។សម្រាប់មន្ទីរពិសោធន៍ដោយគ្មានប្រាក់ច្រើន នៅពេលដែលពួកគេទទួលបាន primers ច្រើន ពួកគេអាចប្រើ RT-PCR ធម្មតាដើម្បីមើលថាតើវាជាក្រុមតែមួយ និងកំណត់អត្តសញ្ញាណជាក់លាក់នៃ primers ។ប្រសិនបើមន្ទីរពិសោធន៍មិនខ្វះលុយទេ ភាពជាក់លាក់នៃ primers ទាំងអស់អាចត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណតែម្តងតាមរយៈខ្សែកោងរលាយ។

4 តើអ្នកប្រាកដថាលក្ខខណ្ឌពិសោធន៍របស់អ្នកគឺសមរម្យទេ?

SYBR គួរតែត្រូវបានការពារពីពន្លឺខ្លាំង ដូច្នេះព្យាយាមបិទភ្លើងពីលើនៅពេលបន្ថែម SYBR reagent ហើយគ្រាន់តែត្រូវការប្រើពន្លឺស្រអាប់ប៉ុណ្ណោះដើម្បីបញ្ចប់វា។

ទុក SYBR នៅ 4°C។នៅពេលប្រើ សូមដាក់បញ្ច្រាសឡើងលើចុះក្រោមថ្នមៗ ដើម្បីលាយចូលគ្នាឱ្យបានល្អ ដើម្បីកុំឱ្យមានពពុះ ហើយកុំឱ្យខ្យល់ចេញចូលខ្លាំង។

ប្អូនស្រីខ្លះចូលចិត្តគូសលើបន្ទះ PCR ព្រោះខ្លាចលាយសំណាកខុស។ដោយសារតែសញ្ញាសម្គាល់របស់អ្នកទំនងជាប៉ះពាល់ដល់ការប្រមូលផ្ដុំនៃសញ្ញា fluorescent ជាទូទៅខ្ញុំណែនាំអោយក្មេងតូចៗប្រើសៀវភៅពិសោធន៍ដើម្បីជួយក្នុងការចងចាំ ដូចដែលបានបង្ហាញខាងក្រោម។

រូប។ដ្យាក្រាមផ្ទុកគំរូ qRT-PCR

5 តើអ្នកប្រាកដថាអ្នកកំពុងធ្វើវាត្រឹមត្រូវទេ?

ត្រូវប្រាកដថាពាក់ស្រោមដៃពាក់ស្រោមដៃពាក់ស្រោមដៃហើយនិយាយរឿងសំខាន់បីដង។

ដើម្បីកាត់បន្ថយការប៉ះពាល់របស់ SYBR ទៅនឹងពន្លឺ ខ្ញុំផ្ទាល់ចង់បន្ថែមគំរូជាមុន ដូចបង្ហាញក្នុងរូបភាពខាងក្រោម។យោងតាមបទពិសោធន៍ ការបន្ថែមគំរូមួយចំនួនតូចទំនងជាបណ្តាលឱ្យមានកំហុសក្នុងការធ្វើគំរូ។ដូច្នេះ ដើម្បីកាត់បន្ថយកំហុសឆ្គងដែលបណ្តាលមកពីការបន្ថែមគំរូមួយចំនួនតូច ជាធម្មតាខ្ញុំយកគំរូម្តងទៀតពីរដង ហើយបង្កើនចំនួនទ្វេដងនៅពេលបន្ថែមគំរូ ដើម្បីកាត់បន្ថយបរិមាណ H2O2 ដែលបានបន្ថែម។

រូប។ដ្យាក្រាមគ្រោងការណ៍នៃការផ្ទុក qRT-PCR

បន្ទាប់មកកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធ qRT-PCR ដូចខាងក្រោម។

រូប។ដ្យាក្រាមរៀបចំប្រព័ន្ធ qRT-PCR

ចំណាំ៖ ដំណើរការកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធចាំបាច់ត្រូវធ្វើនៅលើទឹកកក។

បនា្ទាប់ពីបន្ថែមគំរូសូមបិទភ្ជាប់ខ្សែភាពយន្តបិទភ្ជាប់ដែលមានតម្លាភាព។ព្យាយាមមិនឱ្យប៉ះផ្ទៃនៃខ្សែភាពយន្តបិទភ្ជាប់ថ្លាដោយដៃរបស់អ្នក គ្រាន់តែដំណើរការពីចន្លោះនៅលើផ្នែកទាំងពីរនៃខ្សែភាពយន្ត។ដោយសារតែស្នាមម្រាមដៃក៏អាចប៉ះពាល់ដល់ការប្រមូលផ្តុំនៃសញ្ញា fluorescent ផងដែរ។បន្ទាប់មកប្រើ centrifuge ដើម្បី centrifuge យ៉ាងឆាប់រហ័សរយៈពេល 10 s ក្នុងល្បឿនទាប ដើម្បីការពារគំរូពីការព្យួរនៅលើជញ្ជាំង។

ផលិតផលដែលពាក់ព័ន្ធ៖

ឧបករណ៍ Cell Direct RT-qPCR

RT ងាយស្រួល II