កូវីដ-១៩ គឺជាជំងឺឆ្លងដែលបង្កឡើងដោយរោគសញ្ញាផ្លូវដង្ហើមធ្ងន់ធ្ងរ កូរ៉ូណាប្រភេទទី 2។ នៅពេលដែលមនុស្សម្នាក់ឆ្លងមេរោគ រោគសញ្ញាទូទៅបំផុតរួមមានគ្រុនក្តៅ ក្អក និងដង្ហើមខ្លី។

សំណាកដែលប្រើសម្រាប់ធ្វើតេស្តអាចប្រមូលបានដោយថង់ទឹកមាត់ច្រមុះ ឬថង់ទឹកមាត់។

PCR ជាអ្វី?

វិធីសាស្រ្តស្តង់ដារនៃការរកឃើញមេរោគឆ្លងគឺប្រតិកម្មខ្សែសង្វាក់ polymerase, PCR ។នេះគឺជាវិធីសាស្រ្តមួយដែលត្រូវបានប្រើប្រាស់យ៉ាងទូលំទូលាយនៅក្នុងជីវវិទ្យាម៉ូលេគុល។វាអាចចម្លងបំណែក DNA ជាក់លាក់ពីរាប់លានទៅរាប់ពាន់លានយ៉ាងឆាប់រហ័ស។

មេរោគថ្មីនេះមានផ្ទុកនូវហ្សែន RNA តែមួយខ្សែវែង។ដើម្បីរកឃើញមេរោគទាំងនេះដោយ PCR ម៉ូលេគុល RNA ត្រូវតែបំប្លែងទៅជាលំដាប់ DNA បំពេញបន្ថែមរបស់ពួកគេដោយ transcriptase បញ្ច្រាស ហើយបន្ទាប់មក DNA ដែលសំយោគថ្មីអាចត្រូវបានពង្រីកដោយនីតិវិធី PCR ស្តង់ដារ ដែលត្រូវបានគេស្គាល់ជាទូទៅថា RT-PCR ។

ដំណើរការ RT-PCR

ការទាញយក RNA

ដើម្បីអនុវត្តវិធីសាស្រ្តនេះ RNA មេរោគគួរតែត្រូវបានទាញយកជាមូលដ្ឋាន។ឧបករណ៍បន្សុត RNA ជាច្រើនប្រភេទអាចត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការបំបែកដោយងាយស្រួល រហ័ស និងមានប្រសិទ្ធភាព។

ដើម្បីទាញយក RNA មេរោគដោយប្រើឧបករណ៍ពាណិជ្ជកម្ម ជាដំបូងត្រូវបន្ថែមគំរូទៅបំពង់ microcentrifuge ហើយបន្ទាប់មកលាយវាជាមួយ lysis buffer ។សតិបណ្ដោះអាសន្ននេះមានសារធាតុ denatured ខ្ពស់ ហើយជាធម្មតាមាន phenol និង guanidine isothiocyanate ។លើសពីនេះទៀត RNase inhibitors ជាធម្មតាមានវត្តមាននៅក្នុងសតិបណ្ដោះអាសន្ន lysis ដើម្បីធានាឱ្យមានភាពឯកោនៃ RNA មេរោគដែលនៅដដែល។

បនា្ទាប់ពីបន្ថមសតិបណ្ដោះអាសន្នលីហ្សីស បញ្ចូលបំពង់លាយដោយជីពចរ និងភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។បន្ទាប់មក មេរោគ​ត្រូវ​បាន​គេ​ធ្វើ​ឱ្យ​ស្ថិត​នៅ​ក្រោម​លក្ខខណ្ឌ​ដែល​មាន​លក្ខណៈ​ក្រាស់​ខ្លាំង​ដែល​ផ្តល់​ឱ្យ​ដោយ​សតិ​បណ្ដោះអាសន្ន​លី​ហ្សែ​ន​។

បន្ទាប់ពីសំណាកត្រូវបាន lysed បំពង់ centrifuge ត្រូវបានប្រើសម្រាប់នីតិវិធីបន្សុត។គំរូត្រូវបានផ្ទុកទៅក្នុងបំពង់ centrifuge ហើយបន្ទាប់មក centrifuged ។

នីតិវិធីនេះគឺជាវិធីសាស្រ្តទាញយកដំណាក់កាលរឹងដែលដំណាក់កាលស្ថានីមានម៉ាទ្រីសស៊ីលីកាជែល។

នៅក្រោមលក្ខខណ្ឌអំបិល និង pH ល្អបំផុត ម៉ូលេគុល RNA ភ្ជាប់ទៅនឹងភ្នាសស៊ីលីកា។

ក្នុងពេលជាមួយគ្នានេះប្រូតេអ៊ីននិងសារធាតុកខ្វក់ផ្សេងទៀតត្រូវបានយកចេញ។

បន្ទាប់ពីការដាក់ centrifugation ដាក់បំពង់ centrifuge ចូលទៅក្នុងបំពង់ប្រមូលស្អាត បោះចោល filtrate ហើយបន្ទាប់មកបន្ថែមសតិបណ្ដោះអាសន្នបោកគក់។

ដាក់បំពង់នៅក្នុង centrifuge ម្តងទៀតដើម្បីបង្ខំសតិបណ្ដោះអាសន្នលាងតាមរយៈភ្នាស។ការធ្វើបែបនេះនឹងកម្ចាត់ចោលនូវភាពមិនស្អាតដែលនៅសេសសល់ទាំងអស់ចេញពីភ្នាស ដោយបន្សល់ទុកតែ RNA ដែលភ្ជាប់ទៅនឹងស៊ីលីកាជែល។

បនា្ទាប់ពីលាងសំណាករួច ចូរដាក់បំពង់ចូលទៅក្នុងបំពង់មីក្រូ centrifuge ដ៏ស្អាតមួយ ហើយបន្ថែមសតិបណ្ដោះអាសន្ន elution ។

បន្ទាប់មកវាត្រូវបាន centrifuged ដើម្បីបង្ខំ elution buffer តាមរយៈភ្នាស។សតិបណ្ដោះអាសន្ន elution ដក RNA មេរោគចេញពីជួរឈរបង្វិល និងទទួលបាន RNA បន្សុត ដោយគ្មានប្រូតេអ៊ីន សារធាតុរារាំង និងសារធាតុកខ្វក់ផ្សេងទៀត។

ជំហានទី 2

ការប្រមូលផ្តុំចម្រុះ

បន្ទាប់ពីទាញយក RNA មេរោគ ជំហានបន្ទាប់គឺរៀបចំល្បាយប្រតិកម្មសម្រាប់ការពង្រីក PCR ។នៅក្នុងជំហាននេះការផ្តោតអារម្មណ៍ត្រូវបានប្រើ។សូលុយស្យុងប្រមូលផ្តុំនេះគឺជាដំណោះស្រាយប្រមូលផ្តុំជាមុនដែលរួមមាន premix, reverse transcriptase, nucleotides, forward primer, reverse primer, TaqMan probe និង DNA polymerase ។

ជាចុងក្រោយ ដើម្បីបំពេញល្បាយប្រតិកម្មនេះ គំរូ RNA ត្រូវបានបន្ថែម។បំពង់ត្រូវបានលាយបញ្ចូលគ្នាដោយ vortexing ជីពចរ ហើយបន្ទាប់មកល្បាយប្រតិកម្មត្រូវបានផ្ទុកទៅក្នុងចាន PCR ។ចាន PCR ជាធម្មតាមាន 96 អណ្តូង ហើយអាចវិភាគសំណាកជាច្រើនក្នុងពេលតែមួយ។

ជំហានទី 3

ការពង្រីក PCR

បន្ទាប់មកដាក់ចាននៅក្នុងម៉ាស៊ីន PCR ដែលសំខាន់គឺម៉ាស៊ីនកំដៅ។

ពេលវេលាពិត RT-PCR ត្រូវបានប្រើដើម្បីរកមើលមេរោគប្រលោមលោកឆ្នាំ 2019 ដោយការពង្រីកលំដាប់គោលដៅនៅក្នុងហ្សែន RdrRP ហ្សែន E និងហ្សែន N ។ជម្រើសនៃហ្សែនគោលដៅគឺអាស្រ័យលើលំដាប់បឋម និងលំដាប់ស៊ើបអង្កេត។

ជំហានដំបូងនៃ RT-PCR គឺការចម្លងបញ្ច្រាស។ខ្សែទីមួយនៃ DNA បំពេញបន្ថែមត្រូវបានសំយោគ ដែលត្រូវបានផ្តួចផ្តើមដោយ PCR បញ្ច្រាស primer ដែលភ្ជាប់ទៅនឹងផ្នែកបន្ថែមនៃហ្សែន RNA មេរោគ។បន្ទាប់មក reverse transcriptase បន្ថែម DNA nucleotides ទៅចុង 3′ នៃ primer ដើម្បីសំយោគ DNA បន្ថែមទៅនឹង RNA មេរោគ។សីតុណ្ហភាព និងរយៈពេលនៃជំហាននេះអាស្រ័យលើ primers គោលដៅ RNA និង reverse transcriptase ដែលបានប្រើ។

បន្ទាប់មក ជំហាន denaturation ដំបូងត្រូវបានអនុវត្ត ដែលនាំឱ្យ denaturation នៃ RNA-DNA hybrid ។ជំហាននេះគឺចាំបាច់ដើម្បីធ្វើឱ្យ DNA polymerase សកម្ម។ក្នុងពេលជាមួយគ្នានេះ ប្រតិចារិកបញ្ច្រាសគឺអសកម្ម។

PCR មានស៊េរីនៃវដ្តកម្ដៅ។វដ្តនីមួយៗមាន denaturation, annealing និងជំហានបន្ថែម។

ជំហាន denaturation ពាក់ព័ន្ធនឹងការឡើងកំដៅអង្គជំនុំជម្រះប្រតិកម្មដល់ 95 អង្សាសេ ហើយប្រើវាសម្រាប់ការប្រែពណ៌នៃគំរូ DNA ពីរខ្សែ។

នៅជំហានបន្ទាប់ សីតុណ្ហភាពប្រតិកម្មត្រូវបានកាត់បន្ថយមកត្រឹម 58 អង្សារសេ ដែលអនុញ្ញាតឱ្យ primer បន្តទៅផ្នែកបន្ថែមនៃគំរូ DNA ដែលមានខ្សែតែមួយរបស់វា។សីតុណ្ហភាព annealing ដោយផ្ទាល់អាស្រ័យលើប្រវែងនិងសមាសភាពនៃ primer ។

នៅក្នុងជំហានបន្ថែម DNA polymerase សំយោគខ្សែ DNA ថ្មីមួយដែលបំពេញបន្ថែមទៅខ្សែគំរូ DNA ។ដោយការបន្ថែមនុយក្លេអ៊ែសេរីបន្ថែមទៅគំរូក្នុងទិសដៅ 5′ ទៅ 3′ ពីល្បាយប្រតិកម្ម។សីតុណ្ហភាពនៃជំហាននេះអាស្រ័យលើ DNA polymerase ដែលបានប្រើ។

បន្ទាប់ពីវដ្តទី 1 គោលដៅ DNA ពីរខ្សែត្រូវបានទទួល។

បន្ទាប់មកចូលទៅក្នុងវដ្តទីពីរ។DNA ខ្សែពីរត្រូវបានបង្កើតឡើងដើម្បីផលិតម៉ូលេគុល DNA ខ្សែតែមួយ។

នៅជំហានបន្ទាប់ សីតុណ្ហភាពប្រតិកម្មត្រូវបានបន្ទាប សារធាតុ primers ត្រូវបាន annealed ទៅនឹងគំរូ DNA តែមួយខ្សែនីមួយៗ ហើយ Taq-man probe ត្រូវបាន annealed ទៅផ្នែកបន្ថែមនៃ DNA គោលដៅ។

ការស៊ើបអង្កេត TaqMan មាន fluorophore covalently ភ្ជាប់ទៅ 5′ ចុងបញ្ចប់នៃការស៊ើបអង្កេត oligonucleotide ។នៅពេលដែលរំភើបដោយប្រភពពន្លឺនៃអ្នកជិះកង់ fluorophore បញ្ចេញ fluorescence ។លើសពីនេះ ការស៊ើបអង្កេតត្រូវបានផ្សំឡើងដោយ quencher នៅចុងបញ្ចប់ 3′។ភាពជិតនៃហ្សែនអ្នករាយការណ៍ទៅនឹង quencher ការពារការរកឃើញនៃ fluorescence ។

នៅក្នុងជំហានបន្ថែម DNA polymerase សំយោគខ្សែថ្មី។នៅពេលដែលវត្ថុធាតុ polymerase ឈានដល់ការស៊ើបអង្កេត TaqMan សកម្មភាព 5′ នុយក្លេអ៊ែរ endogenous របស់វាបំបែកការស៊ើបអង្កេតដោយបំបែកសារធាតុជ្រលក់ចេញពីឧបករណ៍ពន្លត់។

ជាមួយនឹងវដ្តនីមួយៗនៃ PCR ម៉ូលេគុលថ្នាំជ្រលក់កាន់តែច្រើនត្រូវបានបញ្ចេញ ដែលបណ្តាលឱ្យមានការកើនឡើងនៃអាំងតង់ស៊ីតេ fluorescence សមាមាត្រទៅនឹងចំនួន amplicons ដែលត្រូវបានសំយោគ។

វិធីសាស្រ្តនេះអនុញ្ញាតឱ្យប៉ាន់ប្រមាណចំនួននៃលំដាប់ដែលបានផ្តល់ឱ្យមានវត្តមាននៅក្នុងគំរូ។ចំនួននៃបំណែក DNA ដែលជាប់ខ្សែពីរដងកើនឡើងទ្វេដងក្នុងវដ្តនីមួយៗ។ដូច្នេះ PCR អាចត្រូវបានប្រើដើម្បីវិភាគគំរូតូចបំផុត។

សម្រាប់ការវាស់វែងសញ្ញា fluorescent ចង្កៀង halogen tungsten តម្រងរំភើប កញ្ចក់ឆ្លុះ កញ្ចក់ តម្រងបំភាយ និងសាកថ្មឧបករណ៍-ប្រើកាមេរ៉ា CCD ។

ជំហានទី 4 រកឃើញ

សម្រាប់ការវាស់វែងសញ្ញា fluorescent ចង្កៀង halogen tungsten តម្រងរំភើប កញ្ចក់ឆ្លុះ កញ្ចក់ តម្រងបំភាយ និងសាកថ្មឧបករណ៍-ប្រើកាមេរ៉ា CCD ។

ពន្លឺដែលបានត្រងចេញពីចង្កៀងត្រូវបានឆ្លុះបញ្ចាំងដោយឧបករណ៍ឆ្លុះបញ្ចាំង ឆ្លងកាត់កញ្ចក់ condenser និងត្រូវបានផ្តោតទៅកណ្តាលនៃរន្ធនីមួយៗ។បន្ទាប់មក fluorescence ដែលបញ្ចេញចេញពីរន្ធត្រូវបានឆ្លុះបញ្ចាំងពីកញ្ចក់ ឆ្លងកាត់តម្រងបំភាយ និងត្រូវបានរកឃើញដោយកាមេរ៉ា CCD ។នៅក្នុងវដ្ត PCR នីមួយៗ ពន្លឺ fluorophore ដែលរំភើបដោយខ្លួនឯងអាចត្រូវបានរកឃើញដោយ CCD ។

វាបំប្លែងពន្លឺដែលបានចាប់យកទៅជាទិន្នន័យឌីជីថល។វិធីសាស្រ្តនេះត្រូវបានគេហៅថា PCR ពេលវេលាពិត ហើយវាអនុញ្ញាតឱ្យមានការត្រួតពិនិត្យពេលវេលាជាក់ស្តែងនៃដំណើរការនៃប្រតិកម្ម PCR ។