PCR (ប្រតិកម្មខ្សែសង្វាក់វត្ថុធាតុ polymerase) គឺជាបច្ចេកវិទ្យាមួយក្នុងចំនោមបច្ចេកវិទ្យាពង្រីក DNA នៅក្នុង vitro ដែលមានប្រវត្តិជាង 30 ឆ្នាំ។

បច្ចេកវិទ្យា PCR ត្រូវបានត្រួសត្រាយដោយ Kary Mullis នៃ Cetus សហរដ្ឋអាមេរិកក្នុងឆ្នាំ 1983 ។ Mullis បានដាក់ពាក្យសុំប៉ាតង់ PCR ក្នុងឆ្នាំ 1985 ហើយបានបោះពុម្ពក្រដាសសិក្សា PCR ដំបូងបង្អស់ស្តីពីវិទ្យាសាស្រ្តក្នុងឆ្នាំដដែល។Mullis បានទទួលរង្វាន់ណូបែលផ្នែកគីមីវិទ្យាក្នុងឆ្នាំ 1993 សម្រាប់ការងាររបស់គាត់។

គោលការណ៍ជាមូលដ្ឋាននៃ PCR

PCR អាចពង្រីកបំណែក DNA គោលដៅបានច្រើនជាងមួយលានដង។គោលការណ៍នេះគឺស្ថិតនៅក្រោមកាតាលីករនៃ DNA polymerase ដោយប្រើ DNA strand មេជាគំរូ និង primer ជាក់លាក់ជាចំណុចចាប់ផ្តើមសម្រាប់ផ្នែកបន្ថែម។វាត្រូវបានចម្លងនៅក្នុង vitro តាមរយៈជំហានដូចជា denaturation, annealing និង extension ។ដំណើរ​ការ​នៃ DNA របស់​កូន​ស្រី​ដែល​បំពេញ​បន្ថែម​ទៅ​នឹង​គំរូ DNA របស់​មេ។

ដំណើរការ PCR ស្តង់ដារត្រូវបានបែងចែកជាបីដំណាក់កាល៖

1.Denaturation: ប្រើសីតុណ្ហភាពខ្ពស់ដើម្បីបំបែក DNA ទ្វេរដង។ចំណងអ៊ីដ្រូសែនរវាងខ្សែ DNA ទ្វេត្រូវបានខូចនៅសីតុណ្ហភាពខ្ពស់ (93-98 ℃) ។

2.Annealing: បន្ទាប់ពី DNA ខ្សែពីរត្រូវបានបំបែក បន្ថយសីតុណ្ហភាពដើម្បីឱ្យ primer អាចភ្ជាប់ទៅនឹង DNA ខ្សែតែមួយ។

3.Extension: DNA polymerase ចាប់ផ្តើមសំយោគ strands បំពេញតាម DNA strands ពី primers ចងនៅពេលដែលសីតុណ្ហភាពត្រូវបានបន្ទាប។នៅពេលដែលផ្នែកបន្ថែមត្រូវបានបញ្ចប់ វដ្តមួយត្រូវបានបញ្ចប់ ហើយចំនួននៃបំណែក DNA កើនឡើងទ្វេដង

ការធ្វើឡើងវិញនូវជំហានទាំងបីនេះ 25-35 ដង ចំនួននៃបំណែក DNA នឹងកើនឡើងជាលំដាប់។

ភាពប៉ិនប្រសប់នៃ PCR គឺថា primers ផ្សេងគ្នាអាចត្រូវបានរចនាឡើងសម្រាប់ហ្សែនគោលដៅផ្សេងៗគ្នា ដូច្នេះបំណែកហ្សែនគោលដៅអាចត្រូវបានពង្រីកក្នុងរយៈពេលដ៏ខ្លី។

រហូតមកដល់ពេលនេះ PCR អាចត្រូវបានបែងចែកជាបីប្រភេទគឺ PCR ធម្មតា PCR បរិមាណ fluorescent និង PCR ឌីជីថល។

ជំនាន់ដំបូងនៃ PCR ធម្មតា។

ប្រើឧបករណ៍ពង្រីក PCR ធម្មតា ដើម្បីពង្រីកហ្សែនគោលដៅ ហើយបន្ទាប់មកប្រើ electrophoresis gel agarose ដើម្បីរកឃើញផលិតផល មានតែការវិភាគគុណភាពប៉ុណ្ណោះដែលអាចធ្វើបាន។

គុណវិបត្តិចម្បងនៃ PCR ជំនាន់ទី 1:

1. ងាយនឹងការពង្រីកមិនជាក់លាក់ និងលទ្ធផលវិជ្ជមានមិនពិត។

2.ការរកឃើញត្រូវចំណាយពេលយូរ ហើយប្រតិបត្តិការគឺពិបាក។

3.មានតែការធ្វើតេស្តគុណភាពប៉ុណ្ណោះដែលអាចធ្វើបាន

ជំនាន់ទីពីរ PCR ពេលវេលាពិត

Real-Time PCR ដែលត្រូវបានគេស្គាល់ផងដែរថាជា qPCR ប្រើការស៊ើបអង្កេត fluorescent ដែលអាចបង្ហាញពីវឌ្ឍនភាពនៃប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម និងតាមដានការប្រមូលផ្តុំនៃផលិតផលពង្រីកតាមរយៈការប្រមូលផ្តុំនៃសញ្ញា fluorescent និងវិនិច្ឆ័យលទ្ធផលតាមរយៈខ្សែកោង fluorescence ។វាអាចត្រូវបានកំណត់ដោយជំនួយនៃតម្លៃ Cq និងខ្សែកោងស្តង់ដារ។

ដោយសារតែបច្ចេកវិទ្យា qPCR ត្រូវបានអនុវត្តនៅក្នុងប្រព័ន្ធបិទជិត ប្រូបាប៊ីលីតេនៃការចម្លងរោគត្រូវបានកាត់បន្ថយ ហើយសញ្ញា fluorescence អាចត្រូវបានត្រួតពិនិត្យសម្រាប់ការរកឃើញបរិមាណ ដូច្នេះវាត្រូវបានប្រើប្រាស់យ៉ាងទូលំទូលាយបំផុតក្នុងការអនុវត្តគ្លីនិក ហើយបានក្លាយជាបច្ចេកវិទ្យាលេចធ្លោនៅក្នុង PCR ។

សារធាតុ fluorescent ដែលប្រើក្នុង PCR បរិមាណ fluorescent ពេលវេលាពិតអាចត្រូវបានបែងចែកជាៈ TaqMan fluorescent probe, molecular beacons និង fluorescent dye ។

1) ការស៊ើបអង្កេត fluorescent TaqMan:

កំឡុងពេលពង្រីក PCR ការស៊ើបអង្កេត fluorescent ជាក់លាក់មួយត្រូវបានបន្ថែមខណៈពេលដែលបន្ថែម primer មួយគូ។ការស៊ើបអង្កេតគឺជា oligonucleotide ហើយចុងទាំងពីរត្រូវបានដាក់ស្លាកដោយក្រុម fluorescent អ្នករាយការណ៍ និងក្រុម quencher fluorescent ។

នៅពេលដែលការស៊ើបអង្កេតគឺនៅដដែល សញ្ញា fluorescent បញ្ចេញដោយក្រុមអ្នករាយការណ៍ត្រូវបានស្រូបយកដោយក្រុម quenching;កំឡុងពេលពង្រីក PCR សកម្មភាព exonuclease 5′-3′ នៃអង់ស៊ីម Taq កាត់ និងបន្ថយការស៊ើបអង្កេត ធ្វើឱ្យក្រុម fluorescent អ្នករាយការណ៍ និង quencher ក្រុម fluorescent ត្រូវបានបំបែកចេញ ដូច្នេះប្រព័ន្ធត្រួតពិនិត្យ fluorescence អាចទទួលបានសញ្ញា fluorescence ពោលគឺរាល់ពេលដែល DNA strand ត្រូវបានពង្រីក fluorescent ម៉ូលេគុលគឺជាសញ្ញាមួយ។ ធ្វើសមកាលកម្មទាំងស្រុងជាមួយនឹងការបង្កើតផលិតផល PCR ។

2) SYBR fluorescent dye:

នៅក្នុងប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម PCR លើសពី SYBR fluorescent dye ត្រូវបានបន្ថែម។បន្ទាប់ពី SYBR fluorescent dye មិនត្រូវបានដាក់បញ្ចូលក្នុង DNA double-strand វាបញ្ចេញសញ្ញា fluorescent ។ម៉ូលេគុលថ្នាំជ្រលក់ SYBR ដែលមិនត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុងខ្សែសង្វាក់នឹងមិនបញ្ចេញសញ្ញា fluorescent ណាមួយឡើយ ដោយហេតុនេះធានាបាននូវសញ្ញា fluorescent ការកើនឡើងនៃផលិតផល PCR ត្រូវបានធ្វើសមកាលកម្មទាំងស្រុងជាមួយនឹងការកើនឡើងនៃផលិតផល PCR ។SYBR ភ្ជាប់ទៅនឹង DNA ពីរខ្សែប៉ុណ្ណោះ ដូច្នេះខ្សែកោងរលាយអាចត្រូវបានប្រើដើម្បីកំណត់ថាតើប្រតិកម្ម PCR ជាក់លាក់ឬអត់។

3) សញ្ញាម៉ូលេគុល៖

វាគឺជាការស៊ើបអង្កេត oligonucleotide ដែលមានស្លាកពីរដង stem-loop ដែលបង្កើតជារចនាសម្ព័ន្ធរបស់ hairpin ប្រហែល 8 bases នៅចុង 5 និង 3 ។លំដាប់នៃអាស៊ីត nucleic នៅចុងទាំងពីរត្រូវបានផ្គូផ្គងបំពេញគ្នា ដែលបណ្តាលឱ្យក្រុម fluorescent និងក្រុម quenching តឹង។បិទ គ្មាន fluorescence នឹងត្រូវបានផលិតទេ។

បន្ទាប់ពីផលិតផល PCR ត្រូវបានបង្កើត ក្នុងអំឡុងពេលដំណើរការ annealing ផ្នែកកណ្តាលនៃម៉ូលេគុល beacon ត្រូវបានផ្គូផ្គងជាមួយនឹងលំដាប់ DNA ជាក់លាក់មួយ ហើយហ្សែន fluorescent ត្រូវបានបំបែកចេញពីហ្សែន quencher ដើម្បីបង្កើត fluorescence ។

គុណវិបត្តិចម្បងនៃ PCR ជំនាន់ទីពីរ:

ភាពរសើបនៅតែខ្វះខាត ហើយការរកឃើញគំរូចម្លងទាបគឺមិនត្រឹមត្រូវទេ។

មានឥទ្ធិពលនៃតម្លៃផ្ទៃខាងក្រោយ ហើយលទ្ធផលគឺងាយនឹងជ្រៀតជ្រែក។

នៅពេលដែលមាន PCR inhibitors នៅក្នុងប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម លទ្ធផលរកឃើញគឺងាយនឹងមានការរំខាន។

PCR ឌីជីថលជំនាន់ទីបី

ឌីជីថល PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) គណនាលេខចម្លងនៃលំដាប់គោលដៅតាមរយៈការរកឃើញចំណុចបញ្ចប់ ហើយអាចធ្វើការរកឃើញបរិមាណពិតប្រាកដដោយមិនចាំបាច់ប្រើការគ្រប់គ្រងខាងក្នុង និងខ្សែកោងស្តង់ដារ។

ឌីជីថល PCR ប្រើការរកឃើញចំណុចបញ្ចប់ និងមិនអាស្រ័យលើតម្លៃ Ct (កម្រិតនៃវដ្ត) ដូច្នេះប្រតិកម្ម PCR ឌីជីថលត្រូវបានប៉ះពាល់តិចជាងដោយប្រសិទ្ធភាពនៃការពង្រីក ហើយការអត់ធ្មត់ចំពោះប្រតិកម្ម PCR ត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរឡើង ជាមួយនឹងភាពត្រឹមត្រូវខ្ពស់ និងការផលិតឡើងវិញ។

ដោយសារតែលក្ខណៈនៃភាពប្រែប្រួលខ្ពស់ និងភាពត្រឹមត្រូវខ្ពស់ វាមិនត្រូវបានជ្រៀតជ្រែកយ៉ាងងាយស្រួលដោយថ្នាំទប់ស្កាត់ប្រតិកម្ម PCR ទេ ហើយវាអាចសម្រេចបាននូវបរិមាណពិតប្រាកដដោយគ្មានផលិតផលស្តង់ដារ ដែលបានក្លាយជាចំណុចក្តៅនៃការស្រាវជ្រាវ និងកម្មវិធី។

យោងតាមទម្រង់ផ្សេងគ្នានៃអង្គភាពប្រតិកម្ម វាអាចបែងចែកជាបីប្រភេទធំៗគឺ ប្រព័ន្ធមីក្រូហ្វ្លុយឌីក បន្ទះឈីប និងប្រព័ន្ធដំណក់ទឹក។

1) Microfluidic digital PCR, mdPCR:

ដោយផ្អែកលើបច្ចេកវិទ្យា microfluidic គំរូ DNA ត្រូវបានបំបែក។បច្ចេកវិទ្យាមីក្រូហ្វ្លុយឌីកអាចដឹងពីការអាប់ដេតណាណូគំរូ ឬការបង្កើតដំណក់ទឹកតូចៗ ប៉ុន្តែដំណក់ទឹកទាំងនោះត្រូវការវិធីសាស្ត្រស្រូបយកពិសេស ហើយបន្ទាប់មករួមបញ្ចូលគ្នាជាមួយប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម PCR ។mdPCR ត្រូវបានអនុម័តជាបណ្តើរៗដោយវិធីផ្សេងទៀតជំនួស។

2) PCR ឌីជីថលដែលមានមូលដ្ឋានលើ Droplet, ddPCR:

ប្រើបច្ចេកវិទ្យាបង្កើតដំណក់ទឹកក្នុងប្រេង ដើម្បីដំណើរការគំរូទៅជាដំណក់ទឹក ហើយបែងចែកប្រព័ន្ធប្រតិកម្មដែលមានម៉ូលេគុលអាស៊ីត nucleic ទៅជាដំណក់ទឹកណាណូរាប់ពាន់ ដែលនីមួយៗមិនមានផ្ទុកម៉ូលេគុលគោលដៅអាស៊ីត nucleic ដែលត្រូវរកឃើញ ឬមានម៉ូលេគុលគោលដៅអាស៊ីត nucleic ពីមួយទៅច្រើនដែលត្រូវធ្វើតេស្ត។

3) PCR ឌីជីថលផ្អែកលើបន្ទះឈីប, cdPCR:

ប្រើបច្ចេកវិជ្ជាផ្លូវរាវរួមបញ្ចូលគ្នាដើម្បីឆ្លាក់មីក្រូបំពង់ និងមីក្រូជាច្រើននៅលើ wafers ស៊ីលីកុន ឬកញ្ចក់រ៉ែថ្មខៀវ ហើយគ្រប់គ្រងលំហូរនៃដំណោះស្រាយតាមរយៈសន្ទះត្រួតពិនិត្យផ្សេងៗគ្នា ហើយបែងចែកអង្គធាតុរាវគំរូទៅជា nanometers ដែលមានទំហំដូចគ្នាទៅក្នុងអណ្តូងប្រតិកម្មសម្រាប់ប្រតិកម្ម PCR ឌីជីថល ដើម្បីសម្រេចបាននូវបរិមាណដាច់ខាត។

គុណវិបត្តិចម្បងនៃ PCR ជំនាន់ទីបី:

គ្រឿងបរិក្ខារ និងថ្នាំបន្សាបមានតម្លៃថ្លៃ។

តម្រូវការគុណភាពគំរូគឺខ្ពស់។ប្រសិនបើបរិមាណគំរូលើសពីបរិមាណមីក្រូប្រព័ន្ធ វានឹងមិនអាចកំណត់បរិមាណបានទេ ហើយប្រសិនបើវាតូចពេក ភាពត្រឹមត្រូវនៃបរិមាណនឹងត្រូវកាត់បន្ថយ។

ភាពវិជ្ជមានមិនពិតក៏អាចបង្កើតបានផងដែរ នៅពេលដែលមានការពង្រីកមិនជាក់លាក់។