PCR, ច្រើន PCR, នៅកន្លែង PCR, PCR បញ្ច្រាស, RT-PCR, qPCR (1)–PCR

យើងនឹងតម្រៀបចេញនូវគោលគំនិត ជំហាន និងព័ត៌មានលម្អិតនៃ PCR ផ្សេងៗ

Ⅰ. PCR

ប្រតិកម្មខ្សែសង្វាក់ Polymerase ដែលហៅថា PCR គឺជាបច្ចេកវិទ្យាជីវសាស្ត្រម៉ូលេគុលដែលត្រូវបានប្រើដើម្បីពង្រីកបំណែក DNA ជាក់លាក់។វាអាចត្រូវបានចាត់ទុកថាជាការចម្លង DNA ពិសេសនៅក្នុង vitro ។DNA polymerase (DNA Polymerase I) ត្រូវបានគេរកឃើញនៅដើមឆ្នាំ 1955 ហើយ Klenow Fragment នៃ E. Coli ដែលមានតម្លៃពិសោធន៍ និងជាក់ស្តែង ត្រូវបានរកឃើញដោយ Dr. H. Klenow នៅដើមទសវត្សរ៍ឆ្នាំ 1970 ប៉ុន្តែដោយសារតែអង់ស៊ីមនេះមិនអត់ធ្មត់នឹងសីតុណ្ហភាព សីតុណ្ហភាពខ្ពស់អាច degenerate វា ដូច្នេះហើយវាមិនឆ្លើយតបទៅនឹងប្រតិកម្ម degeneration នៃ polymerase ខ្ពស់នោះទេ។អង់ស៊ីមដែលកំពុងប្រើប្រាស់សព្វថ្ងៃ (ហៅថា Taq polymerase) ត្រូវបានញែកចេញពី Thermus aquaticus ដែលជាបាក់តេរីនៅរដូវក្ដៅក្នុងឆ្នាំ 1976។ លក្ខណៈរបស់វាគឺថាវាអាចទប់ទល់នឹងសីតុណ្ហភាពខ្ពស់ និងជាអង់ស៊ីមដ៏ល្អមួយ ប៉ុន្តែវាត្រូវបានគេប្រើយ៉ាងទូលំទូលាយបន្ទាប់ពីទសវត្សរ៍ឆ្នាំ 1980 ។គោលគំនិតដើមនៃគំរូដើមដំបូងរបស់ PCR គឺស្រដៀងទៅនឹងការជួសជុល និងការចម្លងហ្សែន ដែលត្រូវបានស្នើឡើងដោយលោកវេជ្ជបណ្ឌិត KJell Kleppe ក្នុងឆ្នាំ 1971។ គាត់បានបោះពុម្ភច្បាប់ចម្លងហ្សែនដំបូង និងរយៈពេលខ្លី (ស្រដៀងទៅនឹងប្រតិកម្មវដ្តពីរដំបូងនៃ PCR)។PCR ដែលត្រូវបានបង្កើតឡើងនាពេលបច្ចុប្បន្ននេះត្រូវបានបង្កើតឡើងដោយលោកបណ្ឌិត Kary B. Mullis ក្នុងឆ្នាំ 1983។ វេជ្ជបណ្ឌិត Mullis បានបម្រើក្រុមហ៊ុន PE នៅឆ្នាំនោះ ដូច្នេះ PE មានស្ថានភាពពិសេសនៅក្នុងឧស្សាហកម្ម PCR ។វេជ្ជបណ្ឌិត Mullis បានបោះពុម្ពផ្សាយជាផ្លូវការនូវក្រដាសដែលទាក់ទងដំបូងជាមួយ Saiki និងអ្នកផ្សេងទៀតក្នុងឆ្នាំ 1985។ ចាប់តាំងពីពេលនោះមក ការប្រើប្រាស់ PCR គឺរាប់ពាន់ម៉ាយក្នុងមួយថ្ងៃ ហើយគុណភាពនៃឯកសារដែលពាក់ព័ន្ធអាចត្រូវបានគេនិយាយបានថាធ្វើឱ្យវិធីសាស្រ្តស្រាវជ្រាវជាច្រើនទៀតមិនអាចទទួលយកបាន។ក្រោយមកទៀត បច្ចេកវិទ្យា PCR ត្រូវបានប្រើប្រាស់យ៉ាងទូលំទូលាយក្នុងការស្រាវជ្រាវវិទ្យាសាស្ត្រជីវសាស្ត្រ និងកម្មវិធីព្យាបាល ដែលក្លាយជាបច្ចេកវិទ្យាសំខាន់បំផុតនៃការស្រាវជ្រាវជីវវិទ្យាម៉ូលេគុល។Mullis ក៏បានឈ្នះរង្វាន់ណូបែលឆ្នាំ 1993 ផ្នែកគីមីវិទ្យាផងដែរ។

PCRគោលការណ៍

គោលការណ៍ជាមូលដ្ឋាននៃបច្ចេកវិទ្យា PCR គឺស្រដៀងគ្នាទៅនឹងដំណើរការចម្លងធម្មជាតិនៃ DNA ហើយភាពជាក់លាក់របស់វាអាស្រ័យទៅលើ primer oligonucleotide ដែលបំពេញបន្ថែមទៅនឹងចុងទាំងពីរនៃលំដាប់គោលដៅ។PCR ត្រូវបានផ្សំឡើងដោយ degeneration-annealing-ពង្រីកជំហានប្រតិកម្មជាមូលដ្ឋានចំនួនបី៖ ①Degeneration of template DNA: បន្ទាប់ពីគំរូ DNA ត្រូវបានកំដៅដល់ប្រហែល 93°C ក្នុងរយៈពេលជាក់លាក់មួយ ដំណោះស្រាយ DNA ពីរសម្រាប់ Dual-chain DNA ដែលបង្កើតឡើងដោយ PCR amplification នៃ template DNA ដែលបានចាកចេញ ធ្វើឱ្យវាក្លាយជាសង្វាក់តែមួយសម្រាប់ជុំបន្ទាប់។② ការបញ្ចូល (សមាសធាតុ) នៃគំរូ DNA និង primer៖ បន្ទាប់ពីគំរូ DNA ត្រូវបានកំដៅ និង degenerated ទៅជាសង្វាក់តែមួយ សីតុណ្ហភាពធ្លាក់ចុះដល់ប្រហែល 55°C។លំដាប់បំពេញបន្ថែមនៃ primer និងគំរូ DNA ខ្សែសង្វាក់តែមួយ។③ផ្នែកបន្ថែមនៃ primer៖ គំរូ DNA-ការចង primer គឺផ្អែកលើសកម្មភាពរបស់ TaqDNA polymerase ដែលមាន dNTP ជាវត្ថុធាតុដើមប្រតិកម្ម។រក្សាគោលការណ៍នៃការចម្លង សំយោគខ្សែសង្វាក់ចម្លងពាក់កណ្តាលបម្រុងថ្មី ដែលបំពេញបន្ថែមខ្សែសង្វាក់ DNA គំរូ ហើយដំណើរការចំនួនបីនៃវដ្តនៃការចម្លងឡើងវិញអាចទទួលបាន "ខ្សែសង្វាក់ចម្លងពាក់កណ្តាលបម្រុង" បន្ថែមទៀត ហើយខ្សែសង្វាក់ថ្មីនេះមានម្តងទៀត ក្លាយជាគំរូសម្រាប់វដ្តបន្ទាប់។វាត្រូវចំណាយពេល 2-4 នាទីដើម្បីបញ្ចប់រង្វិលជុំ ហ្សែនគោលដៅអាចត្រូវបានពង្រីកជាច្រើនលានដងក្នុងរយៈពេល 2-3 ម៉ោង។

ស្តង់ដារPCRប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម

ធាតុទាំងប្រាំនៃប្រតិកម្ម PCR

មានសារធាតុសំខាន់ៗចំនួនប្រាំប្រភេទដែលពាក់ព័ន្ធនឹងប្រតិកម្ម PCR គឺ primer អង់ស៊ីម dNTP គំរូ និងសតិបណ្ដោះអាសន្ន (ត្រូវការ Mg2+)។[នីតិវិធី PCR]

ដំណើរការ PCR ស្តង់ដារត្រូវបានបែងចែកជាបីដំណាក់កាល

1. DNA degeneration (90°C-96°C)៖ គំរូ DNA ខ្សែសង្វាក់ពីរនៅក្រោមសកម្មភាពកម្ដៅ ចំណងអ៊ីដ្រូសែនបំបែក បង្កើតជា DNA ខ្សែសង្វាក់តែមួយ។

2. Annealing (25 ℃ -65 ℃): សីតុណ្ហភាពប្រព័ន្ធត្រូវបានកាត់បន្ថយ សារធាតុ primer ត្រូវបានផ្សំជាមួយគំរូ DNA ដើម្បីបង្កើតជាខ្សែសង្វាក់ពីរក្នុងតំបន់។

3. ផ្នែកបន្ថែម (70℃ -75℃): នៅក្រោមសកម្មភាពនៃអង់ស៊ីម Taq (ប្រហែល 72°C ដែលជាសកម្មភាពល្អបំផុត) dNTP ត្រូវបានគេប្រើជាវត្ថុធាតុដើម ពង្រីកពីចុង 5′ នៃ primer → 3′ end ការសំយោគ និងគំរូបំពេញបន្ថែមខ្សែសង្វាក់ DNA គ្នាទៅវិញទៅមក។

វដ្តនីមួយៗត្រូវបាន denatured, annealed និងពង្រីក, ទ្វេដងនៃមាតិកា DNA ។នាពេលបច្ចុប្បន្ននេះ ដោយសារតែតំបន់ពង្រីកខ្លី PCR មួយចំនួនអាចចម្លងបានក្នុងរយៈពេលដ៏ខ្លី ទោះបីជាសកម្មភាពអង់ស៊ីម Taq មិនល្អក៏ដោយ ដូច្នេះវាអាចត្រូវបានផ្លាស់ប្តូរទៅជាពីរជំហាន ពោលគឺការ annealing និង extension អាចត្រូវបានអនុវត្តនៅ 60°C-65°C ក្នុងពេលតែមួយ។ក្នុងគោលបំណងដើម្បីកាត់បន្ថយដំណើរការនៃការលើកនិងការត្រជាក់និងធ្វើអោយប្រសើរឡើងនូវល្បឿនឆ្លើយតប។

លក្ខណៈពិសេសនៃប្រតិកម្ម PCR

● ភាពជាក់លាក់ខ្ពស់។

កត្តាកំណត់ជាក់លាក់នៃការឆ្លើយតប PCR គឺ៖ ①ការរួមបញ្ចូលគ្នាជាក់លាក់នៃ primer និង DNA គំរូ។②គោលការណ៍នៃការផ្គូផ្គងមូលដ្ឋាន។③ភាពស្មោះត្រង់នៃប្រតិកម្មសំយោគ TaqDNA polymerase ។④ ភាពជាក់លាក់ និងការអភិរក្សនៃហ្សែនគោលដៅ។

ការរួមបញ្ចូលគ្នាត្រឹមត្រូវនៃ primers និងគំរូគឺជាគន្លឹះ។ការផ្សារភ្ជាប់នៃ primer និងគំរូនិងផ្នែកបន្ថែមនៃសង្វាក់ primer គឺផ្អែកលើគោលការណ៍នៃការផ្គូផ្គងមូលដ្ឋានអាល់កាឡាំង។ភាពស្មោះត្រង់នៃប្រតិកម្មសំយោគវត្ថុធាតុ polymerase និងភាពធន់នឹងសីតុណ្ហភាពខ្ពស់នៃ Taq DNA polymerase ដើម្បីធ្វើឱ្យការចង (សមាសធាតុ) នៃគំរូ និង primer ក្នុងប្រតិកម្មអាចត្រូវបានអនុវត្តនៅសីតុណ្ហភាពខ្ពស់ជាង។ភាពជាក់លាក់នៃការរួមបញ្ចូលគ្នាត្រូវបានកើនឡើងយ៉ាងខ្លាំង។ឈុតអាចរក្សាកម្រិតភាពត្រឹមត្រូវខ្ពស់។តាមរយៈការជ្រើសរើសតំបន់ហ្សែនគោលដៅដែលមានភាពអភិរក្សខ្ពស់ និងអភិរក្សខ្ពស់ ភាពជាក់លាក់របស់វាគឺខ្ពស់ជាង។

● ភាពប្រែប្រួលខ្ពស់។

បរិមាណផលិតកម្មនៃផលិតផល PCR ត្រូវបានកើនឡើងដោយសន្ទស្សន៍ ដែលអាចពង្រីកគំរូចាប់ផ្តើមរបស់ Picker (PG=10-12) ដើម្បីបង្កើនកម្រិតនៃ microcontroller ដល់កម្រិតមីក្រូក្រាម (μg= -6)។កោសិកាគោលដៅអាចត្រូវបានរកឃើញពី 1 លានកោសិកា។នៅក្នុងការរកឃើញមេរោគ ភាពរសើបនៃ PCR អាចឈានដល់ 3 RFUs (កន្លែងទទេដែលបានបង្កើតឡើង);អត្រារកឃើញអប្បបរមានៅក្នុងវិទ្យាសាស្ត្របាក់តេរីគឺ 3 បាក់តេរី។

● សាមញ្ញ និងលឿន

ការឆ្លុះបញ្ចាំង PCR ប្រើ Taq DNA polymerase សីតុណ្ហភាពខ្ពស់ ដែលបន្ថែមដំណោះស្រាយប្រតិកម្មក្នុងពេលតែមួយ នោះគឺប្រតិកម្ម degeneration-anneal-extension លើដំណោះស្រាយ DNA amplification និងធុងទឹក។ជាទូទៅប្រតិកម្ម amplification ត្រូវបានបញ្ចប់ក្នុងរយៈពេល 2 ទៅ 4 ម៉ោង។ផលិតផលដែលបានបង្កើនជាទូទៅត្រូវបានវិភាគដោយដាវអគ្គិសនី ហើយមិនចាំបាច់ប្រើអ៊ីសូតូប គ្មានការបំពុលវិទ្យុសកម្ម និងងាយស្រួលផ្សព្វផ្សាយ។

● ភាពបរិសុទ្ធនៃសំណាកមានកម្រិតទាប

មិនចាំបាច់បំបែកមេរោគ ឬបាក់តេរី និងកោសិកាវប្បធម៌នោះទេ។ផលិតផលឆៅ DNA និង RNA អាចត្រូវបានប្រើជា amplifier ។ការរកឃើញការពង្រីក DNA អាចត្រូវបានប្រើដោយផ្ទាល់ដោយប្រើសំណាកគ្លីនិកដូចជា ឈាម អង្គធាតុរាវ ទឹកលាងក្អក សក់ កោសិកា និងជាលិការស់។

PCRបញ្ហាទូទៅ

● អវិជ្ជមានមិនពិត គ្មានក្រុមពង្រីក

ដំណាក់កាលសំខាន់ៗនៃប្រតិកម្ម PCR រួមមានៈ ① ការរៀបចំអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីកគំរូ ② គុណភាព និងភាពជាក់លាក់នៃសារធាតុ primers ③ គុណភាពនៃអង់ស៊ីម ④ លក្ខខណ្ឌវដ្ត PCR ។ការ​ស្វែង​រក​ហេតុផល​ក៏​គួរ​ត្រូវ​បាន​វិភាគ​និង​សិក្សា​សម្រាប់​តំណ​ខាង​លើ។

គំរូ៖ ① គំរូមានប្រូតេអ៊ីនផ្សេងៗ ② គំរូមានផ្ទុកអង់ស៊ីម Taq inhibitor ③ ប្រូតេអ៊ីននៅក្នុងគំរូមិនត្រូវបានលុបចោលទេ ជាពិសេសប្រូតេអ៊ីនក្រុមនៅក្នុងក្រូម៉ូសូម។⑤ degeneration អាស៊ីត nucleic របស់ Deminer មិនមានភាពហ្មត់ចត់ទេ។នៅពេលដែលគុណភាពនៃអង់ស៊ីម និងថ្នាំ primers ល្អ វាមិនមានក្រុម amplification ដែលទំនងជាការព្យាបាលការរំលាយអាហារនៃសំណាក។មានអ្វីមួយខុសជាមួយនឹងដំណើរការទាញយកអាស៊ីត nucleic គំរូ ដូច្នេះដើម្បីរៀបចំដំណោះស្រាយការរំលាយអាហារប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាព និងស្ថិរភាព នីតិវិធីរបស់វាគួរតែត្រូវបានជួសជុល និងមិនត្រូវបានផ្លាស់ប្តូរតាមអំពើចិត្ត។

អសកម្មអង់ស៊ីម៖ អង់ស៊ីមថ្មី ឬអង់ស៊ីមចាស់ និងថ្មីគួរតែត្រូវបានប្រើរួមគ្នាដើម្បីវិភាគថាតើសកម្មភាពអង់ស៊ីមត្រូវបានបាត់បង់ ឬមិនគ្រប់គ្រាន់ ដែលនាំទៅរកភាពអវិជ្ជមានមិនពិត។គួរកត់សំគាល់ថា អង់ស៊ីម Taq ឬ ethidium bromide ជួនកាលត្រូវបានបំភ្លេចចោល។

Primer: គុណភាពនៃ primer ការផ្តោតអារម្មណ៍នៃ primer និងថាតើការផ្តោតអារម្មណ៍នៃ primer ទាំងពីរគឺស៊ីមេទ្រី។វាជាហេតុផលទូទៅសម្រាប់ការបរាជ័យ PCR ឬការកើនឡើងនៃក្រុមគឺមិនសមស្រប ហើយងាយនឹងសាយភាយ។មានបញ្ហាជាមួយនឹងគុណភាពនៃ primers នៃលេខបាច់មួយចំនួន។ថ្នាំ primers ទាំងពីរមានកំហាប់ខ្ពស់ និងកំហាប់ទាប ដែលបណ្តាលឱ្យមានអំព្លីស៊ីមេទ្រីទាប។វិធានការប្រឆាំងគឺ៖ ① ជ្រើសរើសថ្នាំ primer ល្អដើម្បីសំយោគឯកតា។② កំហាប់នៃ primer មិនត្រឹមតែអាស្រ័យទៅលើតម្លៃ OD ប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែថែមទាំងយកចិត្តទុកដាក់ទៅលើអង្គធាតុរាវដើមរបស់ primer ដើម្បីបង្កើត agar sugar gel electrophoresis ។ត្រូវតែមានតំបន់បន្ទះ primer ហើយពន្លឺនៃ primer ទាំងពីរគួរតែស្របគ្នាជាទូទៅ។ខ្សែក្រវាត់ PCR អាចនឹងបរាជ័យនៅពេលនេះ ហើយវាគួរតែត្រូវបានដោះស្រាយជាមួយនឹងអង្គភាពសំយោគបឋម។ប្រសិនបើ primer ខ្ពស់ ពន្លឺមានកម្រិតទាប ហើយកំហាប់របស់វាត្រូវតែមានតុល្យភាពនៅពេលពនឺ។③ ថ្នាំ primer គួរតែត្រូវបានបង់ និងរក្សាទុកក្នុងកំហាប់ខ្ពស់ ដើម្បីការពារការកកច្រើន ឬផ្នែកនៃទូទឹកកករយៈពេលវែង ដែលនឹងធ្វើឱ្យ primer កាន់តែយ៉ាប់យ៉ឺន និង degrade ។④ ការរចនានៃ primer គឺមិនសមហេតុផលទេ ដូចជាប្រវែងនៃ primer មិនគ្រប់គ្រាន់ ហើយ di cluster ត្រូវបានបង្កើតឡើងរវាង primers ។

ការផ្តោតអារម្មណ៍ Mg2+៖ ការផ្តោតអារម្មណ៍ Mg2+ អ៊ីយ៉ុងមានឥទ្ធិពលយ៉ាងខ្លាំងទៅលើប្រសិទ្ធភាពពង្រីក PCR ។ការផ្តោតអារម្មណ៍ខ្លាំងពេកអាចកាត់បន្ថយការរួមភេទផ្ទុយពីការពង្រីក PCR ។ប្រសិនបើកំហាប់ទាបពេក លទ្ធផលពង្រីក PCR នឹងធ្វើឱ្យ PCR amplification បរាជ័យដោយគ្មានក្រុមពង្រីក។

ការផ្លាស់ប្តូរបរិមាណប្រតិកម្ម៖ បរិមាណដែលប្រើក្នុងការពង្រីក PCR គឺ 20ul, 30ul, និង 50ul ឬ 100uL បរិមាណដ៏ធំនៃកម្មវិធីសម្រាប់ពង្រីក PCR ត្រូវបានកំណត់តាមគោលបំណងផ្សេងៗគ្នានៃការស្រាវជ្រាវវិទ្យាសាស្ត្រ និងការធ្វើតេស្តគ្លីនិក។បន្ទាប់ពីធ្វើបរិមាណតូចៗដូចជា 20ul វាចាំបាច់ក្នុងការធ្វើលក្ខខណ្ឌនៃខ្សែនៅពេលបង្កើតទំហំបើមិនដូច្នោះទេវានឹងបរាជ័យ។

ហេតុផលរាងកាយ៖ ការផ្លាស់ប្តូរមានសារៈសំខាន់ខ្លាំងណាស់សម្រាប់ការពង្រីក PCR ។ប្រសិនបើសីតុណ្ហភាព degeneration គឺទាប, ពេលវេលា degeneration គឺខ្លី, វាទំនងជាកើតឡើងនៅក្នុងអវិជ្ជមានមិនពិត;សីតុណ្ហភាព annealing ទាបពេកអាចបណ្តាលឱ្យ amplification មិនជាក់លាក់ និងកាត់បន្ថយប្រសិទ្ធភាព amplification ជាក់លាក់។ប៉ះពាល់យ៉ាងខ្លាំងដល់ការរួមបញ្ចូលគ្នានៃ primers និង templates ដើម្បីកាត់បន្ថយប្រសិទ្ធភាពនៃ PCR amplification ។ជួនកាលវាចាំបាច់ក្នុងការប្រើប្រាស់ទែម៉ូម៉ែត្រស្តង់ដារ ដើម្បីរកមើលភាពប្រែប្រួល កំដៅ និងសីតុណ្ហភាពបន្ថែមនៅក្នុងផ្នែកបន្ថែម ឬចង្ក្រានដែលរលាយក្នុងទឹក ដែលជាហេតុផលមួយសម្រាប់ការបរាជ័យនៃ PCR ។

វ៉ារ្យ៉ង់នៃលំដាប់គោលដៅ៖ ប្រសិនបើលំដាប់គោលដៅកើតឡើង ការផ្លាស់ប្តូរ ឬការលុប ការរួមផ្សំនៃគំរូ និងគំរូត្រូវបានបញ្ចូលគ្នា ឬដោយសារការខ្វះខាតនៃលំដាប់គោលដៅ បឋម និងគំរូនឹងបាត់បង់លំដាប់បំពេញបន្ថែម ហើយការពង្រីក PCR របស់វានឹងមិនជោគជ័យទេ។

● វិជ្ជមានមិនពិត

ក្រុមតន្រ្តីពង្រីក PCR ហាក់ដូចជាស្របជាមួយនឹងក្រុមតន្រ្តីលំដាប់គោលដៅ ហើយជួនកាលក្រុមតន្រ្តីរបស់វាកាន់តែស្អាត និងខ្ពស់ជាង។

ការរចនាបឋមគឺមិនសមស្របទេ៖ លំដាប់ amplification ដែលបានជ្រើសរើស និងលំដាប់ amplification ដែលមិនមានគោលបំណងមានលក្ខណៈដូចគ្នា ដូច្នេះនៅពេលដែល PCR amplification ផលិតផល PCR amplified គឺជាលំដាប់ដែលមិនមានគោលបំណង។លំដាប់គោលដៅខ្លីពេក ឬបឋមខ្លីពេក ហើយវាងាយនឹងវិជ្ជមានមិនពិត។ចាំបាច់ត្រូវរៀបចំឡើងវិញ។

ការបំពុលឆ្លងកាត់នៃលំដាប់គោលដៅ ឬផលិតផលពង្រីក៖ មានហេតុផលពីរសម្រាប់ការបំពុលនេះ៖ ទីមួយ ការបំពុលឆ្លងនៃហ្សែនទាំងមូល ឬផ្នែកធំ ដែលនាំទៅរកភាពវិជ្ជមានមិនពិត។ប្រភេទនៃភាពវិជ្ជមានមិនពិតនេះអាចត្រូវបានដោះស្រាយដោយវិធីសាស្រ្តដូចខាងក្រោម: ប្រុងប្រយ័ត្ននិងទន់ភ្លន់ក្នុងអំឡុងពេលប្រតិបត្តិការដើម្បីការពារលំដាប់គោលដៅពីការស្រូបចូលទៅក្នុងកាំភ្លើងគំរូឬហុយចេញពីបំពង់ centrifugal ។លើកលែងតែអង់ស៊ីម និងសារធាតុដែលមិនអាចទប់ទល់នឹងសីតុណ្ហភាពខ្ពស់ សារធាតុប្រតិកម្ម ឬឧបករណ៍ទាំងអស់គួរតែត្រូវបានសម្លាប់មេរោគដោយសម្ពាធខ្ពស់។បំពង់ centrifugal និងគំរូគួរតែត្រូវបានប្រើក្នុងពេលតែមួយ។នៅពេលចាំបាច់ មុនពេលបន្ថែមសំណាក បំពង់ប្រតិកម្ម និងសារធាតុប្រតិកម្មត្រូវបានប៉ះពាល់នឹងកាំរស្មីអ៊ុលត្រាវីយូឡេ ដើម្បីបំផ្លាញអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីកដែលមានស្រាប់។ទីពីរ បំណែកតូចៗនៅក្នុងការបំពុលបរិយាកាស។បំណែកតូចៗទាំងនេះខ្លីជាងលំដាប់គោលដៅ ប៉ុន្តែពួកវាមានលក្ខណៈដូចគ្នាជាក់លាក់។វាអាចត្រូវបានភ្ជាប់គ្នាទៅវិញទៅមក។បន្ទាប់ពីការបំពេញបន្ថែម primers ផលិតផល PCR អាចត្រូវបានពង្រីកដែលនឹងបណ្តាលឱ្យផលិតកម្មវិជ្ជមានមិនពិត។វាអាចត្រូវបានប្រើដើម្បីកាត់បន្ថយ ឬលុបបំបាត់វិធីសាស្ត្រ PCR សំបុក។

● បង្ហាញក្រុមពង្រីកមិនជាក់លាក់

ក្រុមតន្រ្តីដែលបានបង្ហាញខ្លួនបន្ទាប់ពីការពង្រីក PCR គឺមិនស៊ីគ្នានឹងទំហំដែលរំពឹងទុក ឬធំ ឬតូច ឬក្នុងពេលតែមួយ ឬក្នុងពេលជាមួយគ្នានោះ ខ្សែពង្រីកជាក់លាក់ និងក្រុមពង្រីកមិនជាក់លាក់។ការកើតឡើងនៃក្រុមតន្រ្តីដែលមិនជាក់លាក់គឺ៖ ទីមួយ primers មិនពេញលេញបំពេញបន្ថែមទៅនឹងលំដាប់គោលដៅ ឬវត្ថុធាតុ polymerization នៃ primer ដើម្បីបង្កើតជា di cluster ។ទីពីរគឺថាកំហាប់នៃ MG2 + អ៊ីយ៉ុងគឺខ្ពស់ពេកសីតុណ្ហភាព annealing គឺទាបពេកហើយចំនួននៃវដ្ត PCR គឺទាក់ទង។ទីពីរគុណភាពនិងបរិមាណនៃអង់ស៊ីម។ជារឿយៗ អង់ស៊ីមនៃប្រភពខ្លះងាយនឹងក្រុមមិនពិសេស ហើយអង់ស៊ីមនៃប្រភពផ្សេងទៀតមិនបានកើតឡើងទេ។ជួនកាលការពង្រីកមិនជាក់លាក់នៃអង់ស៊ីមក៏កើតឡើងផងដែរ។វិធានការប្រឆាំងគឺ៖ រចនាឡើងវិញនូវភាពទាក់ទាញប្រសិនបើចាំបាច់។កាត់បន្ថយបរិមាណអង់ស៊ីម ឬជំនួសអង់ស៊ីមនៃប្រភពមួយផ្សេងទៀត។កាត់បន្ថយបរិមាណបឋម បង្កើនបរិមាណគំរូសមស្រប និងកាត់បន្ថយចំនួនវដ្ត។បង្កើនសីតុណ្ហភាព annealing ឱ្យបានត្រឹមត្រូវ ឬប្រើវិធីសាស្រ្តចំណុចសីតុណ្ហភាពពីរ (93 ° C degeneration, annealing និងពង្រីកនៅប្រហែល 65 ° C) ។

● លេច​ចេញ​នូវ​ស្នាម​ឆ្កូត​ឬ​កាសែត​លាប​ពណ៌

ការពង្រីក PCR ជួនកាលហាក់ដូចជាត្រូវបានអនុវត្ត ឬសំបក ឬខ្សែក្រវ៉ាត់ដូចកម្រាលព្រំ។សម្រាប់ហេតុផលដោយសារតែបរិមាណអង់ស៊ីមច្រើនពេកឬគុណភាពអន់នៃអង់ស៊ីម កំហាប់ dNTP ខ្ពស់ពេក កំហាប់ Mg2+ ខ្ពស់ពេក សីតុណ្ហភាព annealing ទាបពេក និងចំនួនវដ្តច្រើនពេក។វិធានការប្រឆាំងគឺ៖ ①កាត់បន្ថយបរិមាណអង់ស៊ីម ឬផ្លាស់ប្តូរអង់ស៊ីមនៃប្រភពផ្សេងទៀត។②កាត់បន្ថយកំហាប់ dNTP ③កាត់បន្ថយកំហាប់ Mg2+ ឱ្យបានត្រឹមត្រូវ។④ បង្កើនបរិមាណនៃគំរូ និងកាត់បន្ថយចំនួនវដ្ត។

ផលិតផលដែលពាក់ព័ន្ធ

PCR Heroᵀᴹ (ជាមួយថ្នាំជ្រលក់)

◮ ភាពស្មោះត្រង់ខ្ពស់: 6 ដងនៃអង់ស៊ីម Taq ធម្មតា;

◮ ល្បឿនពង្រីកកាន់តែលឿន

◮ ភាព​សម្រប​ខ្លួន​របស់​គំរូ​បន្ថែម​ទៀត។

◮ ប្រសិទ្ធភាពពង្រីកកាន់តែខ្ពស់។

◮ ភាពធន់នឹងបរិស្ថានកាន់តែរឹងមាំ៖ ដាក់នៅសីតុណ្ហភាព 37°C ក្នុងមួយសប្តាហ៍ រក្សាបានច្រើនជាង 90% សកម្មភាព។

◮ វាមានសកម្មភាព 5'→3' DNA polymerase និង 5'→3' exonuclease ដោយគ្មានសកម្មភាព exonuclease 3'→5'។

PCR Easyᵀᴹ (ជាមួយថ្នាំជ្រលក់)

ប្រព័ន្ធប្រតិកម្មតែមួយគត់ និងប្រសិទ្ធភាពខ្ពស់ Taq DNA Polymerase ធ្វើឱ្យប្រតិកម្ម PCR មានប្រសិទ្ធភាពបង្កើនភាពជាក់លាក់ និងភាពប្រែប្រួលខ្ពស់។

RT-qPCR Easyᵀᴹ (ជំហានមួយ)-SYBR Green I

◮ ឧបករណ៍មួយជំហានធ្វើឱ្យប្រតិចារិកបញ្ច្រាស និង qPCR ប្រតិកម្មពីរនៅក្នុងបំពង់តែមួយ គ្រាន់តែត្រូវការបន្ថែមគំរូ RNA, បឋម PCR ជាក់លាក់ និង RNase-Free ddH ប៉ុណ្ណោះ។₂O.

◮ ឧបករណ៍នេះអាចវិភាគបរិមាណ RNA មេរោគ ឬតាមដាន RNA យ៉ាងរហ័ស និងមានប្រសិទ្ធភាព។

◮ កញ្ចប់ប្រើប្រាស់សារធាតុចម្លងបញ្ច្រាស Foregene តែមួយគត់ និង Foregene HotStar Taq DNA Polymerase រួមបញ្ចូលគ្នាជាមួយប្រព័ន្ធប្រតិកម្មពិសេសមួយ ដើម្បីបង្កើនប្រសិទ្ធភាពបង្កើនប្រសិទ្ធភាព និងភាពជាក់លាក់នៃប្រតិកម្ម។

◮ ប្រព័ន្ធប្រតិកម្មដែលប្រសើរឡើងធ្វើឱ្យប្រតិកម្មមានភាពរសើបក្នុងការរកឃើញខ្ពស់ ស្ថេរភាពកម្ដៅខ្លាំងជាងមុន និងការអត់ធ្មត់កាន់តែប្រសើរ។

◮ RT-qPCR ងាយស្រួល^TM(មួយជំហាន)- SYBR Green I kit ភ្ជាប់មកជាមួយថ្នាំជ្រលក់ខាងក្នុង ROX ដែលអាចត្រូវបានប្រើដើម្បីលុបបំបាត់ផ្ទៃខាងក្រោយសញ្ញា និងកំហុសសញ្ញារវាងអណ្តូង ដែលងាយស្រួលសម្រាប់អតិថិជនក្នុងការប្រើក្នុងម៉ូដែលផ្សេងៗគ្នានៃឧបករណ៍ PCR បរិមាណ។

RT ងាយស្រួល^TMII (Master Premix សម្រាប់ ការសំយោគ cDNA ខ្សែទីមួយសម្រាប់PCR ពេលវេលាពិត)

សមត្ថភាព​យ៉ាង​មាន​ប្រសិទ្ធភាព​ក្នុង​ការ​លុប gDNA ដែល​អាច​យក gDNA ក្នុង​ពុម្ព​ចេញ​ក្នុង​រយៈ​ពេល ២ នាទី​។

- ប្រព័ន្ធប្រតិចារឹកបញ្ច្រាសប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាព វាចំណាយពេលត្រឹមតែ 15 នាទីដើម្បីបញ្ចប់ការសំយោគនៃ cDNA ខ្សែទីមួយ។

គំរូស្មុគ្រស្មាញ៖ គំរូដែលមានមាតិកា GC ខ្ពស់ និងរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំស្មុគ្រស្មាញក៏អាចត្រលប់មកវិញជាមួយនឹងប្រសិទ្ធភាពខ្ពស់។

-ប្រព័ន្ធប្រតិចារឹកបញ្ច្រាសដែលមានភាពប្រែប្រួលខ្ពស់ គំរូកម្រិត pg ក៏អាចទទួលបាន cDNA ដែលមានគុណភាពខ្ពស់ផងដែរ។

- ប្រព័ន្ធប្រតិចារឹកបញ្ច្រាសមានស្ថេរភាពកំដៅខ្ពស់ សីតុណ្ហភាពប្រតិកម្មល្អបំផុតគឺ 42 ℃ ហើយវានៅតែមានដំណើរការប្រតិចារិកបញ្ច្រាសដ៏ល្អនៅ 50 ℃។