RT-qPCR គឺជាការពិសោធន៍ជាមូលដ្ឋាននៃជីវវិទ្យាម៉ូលេគុល ហើយអ្នកគ្រប់គ្នាត្រូវតែស្គាល់វា។វារួមបញ្ចូលជាចម្បងបីជំហាន៖ ការទាញយក RNA ការចម្លងបញ្ច្រាសទៅក្នុង cDNA និង PCR បរិមាណ fluorescent ពេលវេលាពិត។វាមិនអាចជួយអ្វីបាន?វាទំនងជាមានបញ្ហាជាមួយការពិសោធន៍ចម្លងបញ្ច្រាស!ទោះបីជាវាហាក់បីដូចជាការពិសោធន៍ប្រតិចារិកបញ្ច្រាសគ្រាន់តែត្រូវការបន្ថែម RNA, dNTP, primers និងប្រតិចារិកបញ្ច្រាសទៅបំពង់ centrifuge និងលាយល្អ ប៉ុន្តែនៅក្នុងដំណើរការប្រតិបត្តិការជាក់ស្តែង វានៅតែមានព័ត៌មានលម្អិតជាច្រើនដែលត្រូវយកចិត្តទុកដាក់។តោះស្វែងយល់ពីវា!

តើធ្វើដូចម្តេចដើម្បីវិនិច្ឆ័យគុណភាពនៃ RNA?
ដើម្បីទទួលបាន cDNA គុណភាពនៃ RNA គឺសំខាន់!គុណភាព RNA អាចត្រូវបានរកឃើញជាចម្បងពីទិដ្ឋភាពពីរ៖
(1) សុចរិតភាព RNA៖ភាពត្រឹមត្រូវនៃ RNA អាចត្រូវបានផ្ទៀងផ្ទាត់ដោយ agarose gel electrophoresis. យក eukaryotes ជាឧទាហរណ៍ RNA សរុបពេញលេញមានបីក្រុមច្បាស់លាស់ ទម្ងន់ម៉ូលេគុលពីធំទៅតូចគឺ 28S, 18S, និង 5S, និង 28S គឺភ្លឺពីរដងដូច 18S;ប្រសិនបើក្រុមតន្រ្តីចំនួន 3 អាចត្រូវបានគេមើលឃើញ ប៉ុន្តែប្រភេទក្រុមតន្រ្តីត្រូវបានធ្វើឱ្យព្រិល ឬការសាយភាយ មានន័យថា RNA ត្រូវបានបំផ្លាញដោយផ្នែក។នៅ​ពេល​នេះ សូម​ធ្វើ​ប្រតិកម្ម​ចម្លង​បញ្ច្រាស​ភ្លាមៗ ហើយ​បង្កើន​ការ​បញ្ចូល​ពុម្ព​ឱ្យ​បាន​សមរម្យ។ប្រសិនបើមានតែក្រុមតន្រ្តីដែលមានទម្ងន់ម៉ូលេគុលតូច ឬគ្មានក្រុមណាអាចត្រូវបានគេមើលឃើញ នោះ RNA ត្រូវបានបំផ្លាញទាំងស្រុង ហើយត្រូវការការស្រង់ចេញឡើងវិញ។Agilent 2100 បង្ហាញពីភាពសុចរិតនៃ RNA ជាមួយនឹងដ្យាក្រាមកំពូល និងតម្លៃ RIN ។ប្រសិនបើអាស៊ីត nucleic នៅដដែល បន្ទាត់មូលដ្ឋាននៃ electropherogram គឺសំប៉ែត។ប្រសិនបើអាស៊ីត nucleic ត្រូវបានបំផ្លិចបំផ្លាញយ៉ាងធ្ងន់ធ្ងរ បន្ទាត់មូលដ្ឋានគឺមិនស្មើគ្នា ហើយកម្រិតនៃការរិចរិលកាន់តែច្រើនលេចឡើង។តម្លៃនៃ RIN ឆ្លុះបញ្ចាំងពីភាពសុចរិតនៃ RNA ក្នុងចន្លោះ 0-10 តម្លៃកាន់តែធំ គុណភាពនៃ RNA កាន់តែប្រសើរ។ជាការប្រសើរណាស់, កម្រិតខ្ពស់នៃភាពពេញលេញ។
(2) ភាពបរិសុទ្ធនៃ RNAសមាមាត្រនៃ OD260/280 អាចត្រូវបានរកឃើញដោយកាំរស្មី UV spectrophotometric ។ប្រសិនបើសមាមាត្រនៃ OD260/280 ស្ថិតនៅចន្លោះ 1.9 និង 2.1 នោះភាពបរិសុទ្ធគឺល្អណាស់។
DNA ហ្សែនដែលនៅសេសសល់អាចនាំទៅរកលទ្ធផលបរិមាណមិនត្រឹមត្រូវ
នៅពេលដែល RNA ត្រូវបានស្រង់ចេញ RNA ដែលយើងទទួលបានអាចត្រូវបានលាយជាមួយ DNA ហ្សែន (gDNA) ដែលមិនត្រូវបានសម្អាត។ដូច្នេះ cDNA បន្ទាប់ពីការចម្លងបញ្ច្រាសក៏នឹងត្រូវបានលាយជាមួយផងដែរ។gDNA.កំឡុងពេលទឹកធ្លាក់qPCRប្រតិកម្ម,cDNAហើយ gDNA អាចត្រូវបានពង្រីកក្នុងពេលដំណាលគ្នា ដែលបណ្តាលឱ្យមានតម្លៃ CT តិចតួច ដូច្នេះលទ្ធផលអាចមានភាពលំអៀង។
ដូច្នេះតើយើងគួរធ្វើអ្វីក្នុងស្ថានភាពនេះ?បុព្វបុរសណែនាំ៖
(1) អនុវត្តការសម្អាតហ្សែននៅលើ RNA បញ្ច្រាស ដែលអាចត្រូវបានយកចេញដោយការទាញយកជួរឈរកំឡុងពេលទាញយក RNA ។
(2) ព្យាបាល RNA ស្រង់ចេញដោយ DNaseI ប៉ុន្តែបញ្ចប់វាជាមួយ EDTA;
នៃ reagents transcription បញ្ច្រាសជាមួយម៉ូឌុលបោសសំអាតហ្សែន;

តើធ្វើដូចម្តេចដើម្បីជ្រើសរើស primers សម្រាប់ការចម្លងបញ្ច្រាស?
ថ្នាំចម្លងចម្លងបញ្ច្រាសក៏ប៉ះពាល់ដល់លទ្ធផលនៃប្រតិកម្មប្រតិចារិកបញ្ច្រាសផងដែរ។អ្នកអាចជ្រើសរើសថ្នាំ primers ចៃដន្យ Oligo dT ឬ primers ជាក់លាក់ហ្សែនសម្រាប់ការចម្លងបញ្ច្រាសយោងទៅតាមកាលៈទេសៈជាក់លាក់នៃការពិសោធន៍៖
(1) ប្រតិចារិកជាក់លាក់៖ ថ្នាំ primers ជាក់លាក់នៃហ្សែនត្រូវបានណែនាំ;
(2) ប្រតិចារិកបំណែកវែង៖ ថ្នាំ primers ជាក់លាក់ Oligo dT/ហ្សែន ត្រូវបានណែនាំ។
(3) បំណែកខាងក្នុងនៃប្រតិចារិកផ្នែកវែង: ថ្នាំ primers ជាក់លាក់នៃហ្សែន / ថ្នាំ primers ចៃដន្យ / random primers + Oligo dT ។ប្រសិនបើការពិសោធន៍ qPCR ជាបន្តបន្ទាប់ត្រូវបានអនុវត្ត នោះ Oligo dT មិនអាចប្រើតែម្នាក់ឯងបានទេ ពីព្រោះការប្រើ Oligo dT តែឯងអាចបណ្តាលឱ្យមានលំអៀងចុងក្រោយ 3′ ដែលនាំឱ្យលទ្ធផលពិសោធន៍ qPCR មិនត្រឹមត្រូវ។
(4) miRNA៖ ថ្នាំ primers Stem-loop ឬ primer tailing អាចត្រូវបានប្រើ។

តើផលិតផលចម្លងបញ្ច្រាស cDNA គួរតែត្រូវបានពនឺប៉ុន្មានដងសម្រាប់បរិមាណ?
បន្ទាប់ពីទទួលបាន cDNA នៃផលិតផលចម្លងបញ្ច្រាស តើ cDNA គួរតែត្រូវបានពនឺប៉ុន្មានដងសម្រាប់ការពិសោធន៍ qPCR គឺមានសារៈសំខាន់ខ្លាំងណាស់។ប្រសិនបើកំហាប់ cDNA ខ្ពស់ពេក ឬទាបពេក ប្រសិទ្ធភាពពង្រីកអាចរងផលប៉ះពាល់។តើអាចវាស់កំហាប់ cDNA ហើយតើត្រូវធ្វើដូចម្តេច?
(1) កំហាប់ cDNA នៃផលិតផលចម្លងបញ្ច្រាសមិនអាចវាស់វែងបានទេ ពីព្រោះបន្ថែមពីលើផលិតផល cDNA ផលិតផលចម្លងបញ្ច្រាសក៏មាន Buffer សំណល់ចម្លងបញ្ច្រាស ការចម្លងបញ្ច្រាស សារធាតុ primers ជាដើម ដែលនឹងរំខានដល់លទ្ធផលរង្វាស់កំហាប់ និងបណ្តាលឱ្យ OD260/280, OD260/ 230 ឆ្លុះបញ្ចាំងពីកម្រិតធម្មតា ហើយសមាមាត្រមិនពិត។នៅពេលនេះមិត្តភក្តិខ្លះនឹងនិយាយថាបន្ទាប់មកខ្ញុំនឹងវាស់ការផ្តោតអារម្មណ៍បន្ទាប់ពីការបន្សុត;នៅទីនេះ Foregene សូមរំលឹកថា cDNA មិនត្រូវបានណែនាំអោយបន្សុតទេ ពីព្រោះប្រវែងនៃ cDNA ដែលទទួលបានដោយការបញ្ច្រាស់គឺខុសគ្នា ហើយ cDNA ខ្លីនឹងត្រូវបាត់បង់ក្នុងការបន្សុត។
(២) ដូច្នេះ តើត្រូវធ្វើអ្វី?មុនពេលការពិសោធន៍ qPCR ជម្រាលនៃការពនឺនៃ cDNA អាចត្រូវបានកំណត់តាមរយៈការពិសោធន៍មុន។ឧទាហរណ៍៖ ប្រើដំណោះស្រាយភាគហ៊ុន cDNA ការរំលាយ 10 ដង និង 100 ដងជាគំរូសម្រាប់ការពិសោធន៍ qPCR ហើយជ្រើសរើសកត្តា dilution ជាមួយនឹងតម្លៃ CT ក្នុងចន្លោះ 18-28 ។

តើ miRNAs គួរតែត្រូវបានចម្លងបញ្ច្រាសដោយរបៀបណា?
miRNA គឺជា RNA ម៉ូលេគុលតូចមួយខ្សែតែមួយដែលមានទំហំប្រហែល 22 nt ដែលមិនសរសេរកូដសម្រាប់ប្រូតេអ៊ីន។ដោយសារតែប្រវែងខ្លីរបស់វា វិធីសាស្ត្រ qPCR សាមញ្ញគឺពិបាកក្នុងការកំណត់បរិមាណដោយផ្ទាល់ ដូច្នេះជារឿយៗចាំបាច់ត្រូវពង្រីក miRNA ។វិធីសាស្ត្រចម្លងបញ្ច្រាសដែលប្រើជាទូទៅសម្រាប់ miRNA រួមមាន stem-loop method និង tailing method។
វិធីសាស្រ្ត stem-loop គឺដើម្បីពង្រីក miRNA ដោយបន្ថែម stem-loop primers ។វិធីសាស្ត្ររាវរកនេះមានភាពរសើប និងភាពជាក់លាក់ខ្ពស់ ប៉ុន្តែការរកឃើញមានកម្រិតទាប។ការចម្លងបញ្ច្រាសមួយអាចរកឃើញតែ miRNA មួយ និងឯកសារយោងខាងក្នុងប៉ុណ្ណោះ។វិធីសាស្ត្របន្ថែមកន្ទុយមានពីរ វាត្រូវបានបញ្ចប់ដោយសកម្មភាពរួមគ្នានៃអង់ស៊ីមពីរគឺ PolyA polymerase និង reverse transcriptase ។PolyA polymerase ទទួលខុសត្រូវចំពោះការបន្ថែមកន្ទុយ PolyA ទៅនឹង miRNA ដើម្បីបង្កើនប្រវែងរបស់វា ហើយ transcriptase បញ្ច្រាសធ្វើប្រតិកម្មបញ្ច្រាស។វិធីសាស្រ្តនេះមានដំណើរការរាវរកខ្ពស់ ហើយអាចរកឃើញ miRNAs និងឯកសារយោងខាងក្នុងជាច្រើននៅក្នុងការចម្លងបញ្ច្រាសមួយ ប៉ុន្តែភាពប្រែប្រួល និងភាពជាក់លាក់មានកម្រិតទាបនៅក្នុងវិធីសាស្ត្រ stem-loop ។