PCR គឺជាបច្ចេកវិទ្យាពង្រីកអាស៊ីត nucleic ដែលត្រូវបានប្រើប្រាស់យ៉ាងទូលំទូលាយបំផុត ហើយត្រូវបានគេប្រើយ៉ាងទូលំទូលាយដោយសារតែភាពប្រែប្រួល និងភាពជាក់លាក់របស់វា។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ PCR ទាមទារឱ្យមានការផ្លាស់ប្តូរកម្ដៅម្តងហើយម្តងទៀត ហើយមិនអាចកម្ចាត់ដែនកំណត់នៃការពឹងផ្អែកលើឧបករណ៍ និងឧបករណ៍ ដែលកំណត់ការអនុវត្តន៍របស់វានៅក្នុងការធ្វើតេស្តផ្នែកព្យាបាល។

ចាប់តាំងពីដើមទសវត្សរ៍ឆ្នាំ 1990 មក មន្ទីរពិសោធន៍ជាច្រើនបានចាប់ផ្តើមអភិវឌ្ឍបច្ចេកវិទ្យាបង្កើនសីតុណ្ហភាពថេរ ដែលមិនត្រូវការការប្រែពណ៌ដោយកម្ដៅ។ឥឡូវនេះពួកគេបានបង្កើតបច្ចេកវិទ្យាការពង្រីក isothermal ដែលសម្របសម្រួលដោយរង្វិលជុំ, បច្ចេកវិទ្យាពង្រីក isothermal ជំនួសខ្សែ, បច្ចេកវិទ្យាពង្រីក isothermal រង្វង់វិល និងការពឹងផ្អែកលើលំដាប់អាស៊ីត nucleic ។បច្ចេកវិជ្ជាពង្រីកអ៊ីសូតូម និងបច្ចេកវិទ្យាផ្សេងៗទៀត។ 

Loop-mediated isothermal amplification

គោលការណ៍ពង្រីកគឺផ្អែកលើការពិតដែលថា DNA ស្ថិតនៅក្នុងស្ថានភាពលំនឹងថាមវន្តនៅប្រហែល 65 ° C ។នៅពេលដែល primer ណាមួយត្រូវបានផ្គូផ្គងមូលដ្ឋាន និងពង្រីកទៅផ្នែកបំពេញបន្ថែមនៃ DNA ពីរខ្សែ នោះខ្សែផ្សេងទៀតនឹងបំបែក និងក្លាយជាខ្សែតែមួយ។

នៅសីតុណ្ហភាពនេះ DNA ប្រើ primers ជាក់លាក់ចំនួន 4 ដើម្បីពឹងផ្អែកលើ strand-displacement DNA polymerase ដើម្បីធ្វើឱ្យការសំយោគនៃ strand-displacement DNA ដំណើរការដោយខ្លួនឯងជាបន្តបន្ទាប់។

ដំបូងកំណត់តំបន់ជាក់លាក់ចំនួន 6 F3, F2, F1, B1, B2, B3 នៅលើហ្សែនគោលដៅ ហើយបន្ទាប់មករចនា 4 primers ដោយផ្អែកលើតំបន់ជាក់លាក់ទាំង 6 (ដូចបង្ហាញក្នុងរូបភាពខាងក្រោម)៖

primer ខាងក្នុងទៅមុខ (FIP) ត្រូវបានផ្សំឡើងដោយ F1c និង F2។

primer ខាងក្នុងថយក្រោយ (BIP) ត្រូវបានផ្សំឡើងដោយ B1c និង B2 ហើយ TTTT ត្រូវបានប្រើជា spacer នៅកណ្តាល។

ថ្នាំ primers ខាងក្រៅ F3 និង B3 ត្រូវបានផ្សំឡើងដោយតំបន់ F3 និង B3 នៅលើហ្សែនគោលដៅ។

នៅក្នុងប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម LAMP កំហាប់នៃ primer ខាងក្នុងគឺច្រើនដងនៃ primer ខាងក្រៅ។primer ខាងក្នុងត្រូវបានរួមបញ្ចូលគ្នាជាលើកដំបូងជាមួយនឹងខ្សែគំរូដើម្បីសំយោគខ្សែបន្ថែមដើម្បីបង្កើតជាខ្សែ DNA ទ្វេ។បនា្ទាប់មក primer ខាងក្រៅត្រូវបានផ្សំជាមួយ strand គំរូដើម្បីបង្កើតជា DNA double strand ។នៅក្រោមសកម្មភាពរបស់ BstDNA polymerase ខ្សែបន្ថែមដែលត្រូវបានសំយោគដោយ primer ខាងក្នុងត្រូវបានបញ្ចេញ។បន្ទាប់​ពី​មាន​ប្រតិកម្ម​ជា​បន្តបន្ទាប់ ខ្សែ​ដែល​បំពេញ​បន្ថែម​នៅ​ទី​បំផុត​បង្កើត​បាន​ជា​ខ្សែ DNA មួយ​ដែល​មាន​រចនាសម្ព័ន្ធ​ dumbbell ។

រចនាសម្ព័ន្ធ dumbbell DNA ខ្សែតែមួយដោយខ្លួនវាផ្ទាល់ត្រូវបានគេប្រើជាគំរូដើម្បីបង្កើតជាបន្តនូវរចនាសម្ព័ន្ធ stem-loop DNA បណ្តោះអាសន្នជាមួយនឹងចុងបើកចំហ។ថ្នាំ primers ខាងក្នុង និងខាងក្រៅ ណែនាំ DNA នៃរចនាសម្ព័ន្ធ stem-loop អន្តរកាល ដើម្បីបន្តឆ្លងកាត់ការផ្លាស់ទីលំនៅ និងប្រតិកម្មផ្នែកបន្ថែម ហើយទីបំផុតបង្កើតរចនាសម្ព័ន្ធ stem-loop ជាច្រើនដែលមានប្រវែងខុសៗគ្នា។ល្បាយ DNA ។

គុណសម្បត្តិ និងគុណវិបត្តិនៃការពង្រីក isothermal ដែលសម្របសម្រួលដោយរង្វិលជុំ

គុណសម្បត្តិនៃអំពូលភ្លើង៖

(1) ប្រសិទ្ធភាព amplification ខ្ពស់ ដែលអាចបង្កើនប្រសិទ្ធភាព 1-10 ច្បាប់ចម្លងនៃហ្សែនគោលដៅក្នុងរយៈពេល 1h ហើយប្រសិទ្ធភាព amplification គឺ 10-100 ដងនៃ PCR ធម្មតា។

(2) ពេលវេលាប្រតិកម្មគឺខ្លី ភាពជាក់លាក់ខ្លាំង ហើយមិនត្រូវការឧបករណ៍ពិសេសទេ។

គុណវិបត្តិនៃចង្កៀង:

(1) តម្រូវការសម្រាប់ primers គឺខ្ពស់ជាពិសេស។

(2) ផលិតផលពង្រីកមិនអាចប្រើសម្រាប់ការក្លូន និងបន្តបន្ទាប់គ្នាបានទេ ប៉ុន្តែអាចប្រើបានសម្រាប់តែការវិនិច្ឆ័យប៉ុណ្ណោះ។

(3) ដោយសារតែភាពប្រែប្រួលខ្លាំងរបស់វា វាងាយស្រួលក្នុងការបង្កើត aerosols ដែលបណ្តាលឱ្យមានភាពវិជ្ជមានមិនពិត និងប៉ះពាល់ដល់លទ្ធផលតេស្ត។

Sការពង្រីកការផ្លាស់ទីលំនៅ

Strand displacement amplification (SDA) គឺជាបច្ចេកទេសពង្រីក DNA isothermal in vitro ដោយផ្អែកលើប្រតិកម្មអង់ស៊ីមដែលត្រូវបានស្នើឡើងដំបូងដោយអ្នកប្រាជ្ញអាមេរិក Walker ក្នុងឆ្នាំ 1992 ។

ប្រព័ន្ធមូលដ្ឋាននៃ SDA រួមមានការរឹតបន្តឹង endonuclease ដែលជា DNA polymerase ដែលមានសកម្មភាពផ្លាស់ទីលំនៅ strand ពីរគូនៃ primers, dNTPs និងកាល់ស្យូម និងម៉ាញ៉េស្យូម ions និងប្រព័ន្ធទ្រនាប់។

គោលការណ៍នៃការពង្រីកការផ្លាស់ទីលំនៅរបស់ strand គឺផ្អែកលើការរឹតបន្តឹងដែលបានកែប្រែគីមីតាមលំដាប់នៃការទទួលស្គាល់ endonuclease នៅចុងទាំងពីរនៃ DNA គោលដៅ។endonuclease បើកគម្លាតនៅក្នុង strand DNA នៅកន្លែងទទួលស្គាល់របស់វា ហើយ DNA polymerase ពង្រីកគម្លាត 3′ End និងជំនួសខ្សែ DNA បន្ទាប់។

ខ្សែ DNA តែមួយដែលត្រូវបានជំនួសអាចត្រូវបានផ្សំជាមួយ primers និងពង្រីកទៅជាខ្សែពីរដោយ DNA polymerase ។ដំណើរការនេះត្រូវបានធ្វើម្តងទៀតជាបន្តបន្ទាប់ ដើម្បីឱ្យលំដាប់គោលដៅត្រូវបានពង្រីកយ៉ាងមានប្រសិទ្ធភាព។

គុណសម្បត្តិ និងគុណវិបត្តិនៃបច្ចេកវិទ្យា strand displacement amplification

គុណសម្បត្តិរបស់ SDA៖

ប្រសិទ្ធភាពនៃការពង្រីកគឺខ្ពស់ ពេលវេលាប្រតិកម្មគឺខ្លី ភាពជាក់លាក់គឺខ្លាំង ហើយមិនត្រូវការឧបករណ៍ពិសេសទេ។

គុណវិបត្តិនៃ SDA៖

ផលិតផលមិនមានលក្ខណៈដូចគ្នាទេ ហើយផលិតផលដែលមានខ្សែតែមួយ និងពីរខ្សែ តែងតែត្រូវបានផលិតនៅក្នុងវដ្ត SDA ហើយការកាត់កន្ទុយនឹងកើតឡើងដោយជៀសមិនរួចនៅពេលដែលរកឃើញដោយ electrophoresis ។

Rការពង្រីករង្វង់ olling

ការពង្រីករង្វង់រំកិល (RCA) ត្រូវបានស្នើឡើងដោយការគូរលើវិធីសាស្ត្រចម្លង DNA ពីសារពាង្គកាយបង្កជំងឺដោយរង្វង់វិល។វា​សំដៅ​ទៅ​លើ​ការ​ប្រើ DNA រាង​ជា​រង្វង់​តែមួយ​ជា​គំរូ​នៅ​សីតុណ្ហភាព​ថេរ និង DNA polymerase ពិសេស (ដូចជា Phi29) ) ក្រោម​សកម្មភាព​នៃ​ការ​សំយោគ DNA រង្វង់​វិល​ដើម្បី​សម្រេច​បាន​នូវ​ការ​ពង្រីក​ហ្សែន​គោលដៅ។

RCA អាច​ត្រូវ​បាន​បែង​ចែក​ជា​ការ​ពង្រីក​លីនេអ៊ែរ និង​ការ​ពង្រីក​អិចស្ប៉ូណង់ស្យែល។ប្រសិទ្ធភាពនៃ RCA លីនេអ៊ែរអាចឈានដល់ 10⁵ដង ហើយប្រសិទ្ធភាពនៃ RCA អិចស្ប៉ូណង់ស្យែលអាចឈានដល់ 10⁹ដង។

ភាពខុសគ្នាដ៏សាមញ្ញ ដូចដែលបានបង្ហាញក្នុងរូបខាងក្រោម ការពង្រីកលីនេអ៊ែរ a ប្រើតែ 1 primer ប៉ុណ្ណោះ ការពង្រីកអិចស្ប៉ូណង់ស្យែល b មានបឋម 2 ។

លីនេអ៊ែរ RCA ត្រូវបានគេហៅថា primer RCA តែមួយ។ថ្នាំ primer ភ្ជាប់ទៅនឹង DNA រាងជារង្វង់ ហើយត្រូវបានពង្រីកដោយសកម្មភាពរបស់ DNA polymerase ។ផលិតផលគឺជាខ្សែតែមួយលីនេអ៊ែរដែលមានចំនួនច្រើននៃលំដាប់ដដែលៗរាប់ពាន់ដងនៃប្រវែងនៃរង្វិលជុំតែមួយ។

ចាប់តាំងពីផលិតផលនៃ RCA លីនេអ៊ែរតែងតែត្រូវបានភ្ជាប់ទៅ primer ចាប់ផ្តើម, ការជួសជុលងាយស្រួលនៃសញ្ញាគឺជាអត្ថប្រយោជន៍ដ៏សំខាន់មួយ។

Exponential RCA ដែលត្រូវបានគេស្គាល់ផងដែរថាជា Hyper branched amplification HRCA (Hyper branched RCA) នៅក្នុង exponential RCA សារធាតុ primer មួយពង្រីកផលិតផល RCA សារធាតុ primer ទីពីរ hybridizes ជាមួយផលិតផល RCA ហើយពង្រីក ហើយការជំនួសត្រូវបានចងភ្ជាប់ទៅនឹងផលិតផល RCA រួចហើយ។ primers downstream ពង្រីក strand និងផលិតម្តងទៀត deplndri និងជំនួសផលិតផល RCA ។

គុណសម្បត្តិ និងគុណវិបត្តិនៃការពង្រីកទឹកអាស៊ីត nucleic រង្វង់វិល

គុណសម្បត្តិរបស់ RCA៖

ភាពប្រែប្រួលខ្ពស់ ភាពជាក់លាក់ល្អ និងប្រតិបត្តិការងាយស្រួល។

គុណវិបត្តិនៃ RCA៖

បញ្ហាផ្ទៃខាងក្រោយកំឡុងពេលចាប់សញ្ញា។កំឡុងពេលប្រតិកម្ម RCA ការស៊ើបអង្កេតសោដែលមិនបានផ្សព្វផ្សាយ និងគំរូ DNA ឬ RNA នៃការស៊ើបអង្កេតដែលមិនបានចងអាចបង្កើតសញ្ញាផ្ទៃខាងក្រោយមួយចំនួន។ 

Nការពង្រីកផ្អែកលើលំដាប់ ukleicacid

ការពង្រីកដោយផ្អែកលើលំដាប់អាស៊ីតនុយក្លេអ៊ែរ (NASBA) គឺជាបច្ចេកវិទ្យាថ្មីមួយដែលត្រូវបានបង្កើតឡើងនៅលើមូលដ្ឋាននៃ PCR ។វាគឺជាការពង្រីកអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីកជាបន្ត និង isothermal ដែលត្រូវបានដឹកនាំដោយ primers មួយគូជាមួយនឹងលំដាប់ T7 promoter ។បច្ចេកវិទ្យានេះអាចពង្រីកគំរូ RNA ប្រហែល 109 ដងក្នុងរយៈពេលប្រហែល 2 ម៉ោង ដែលវាខ្ពស់ជាង 1000 ដងនៃវិធីសាស្ត្រ PCR ធម្មតា ហើយមិនត្រូវការឧបករណ៍ពិសេសនោះទេ។

បច្ចេកវិទ្យានេះត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការធ្វើរោគវិនិច្ឆ័យយ៉ាងឆាប់រហ័សនៃជំងឺភ្លាមៗនៅពេលដែលវាបានបង្ហាញខ្លួន ហើយបច្ចុប្បន្នក្រុមហ៊ុនជាច្រើនបានប្រើវិធីសាស្ត្រនេះនៅក្នុងឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា RNA ។

ទោះបីជា RNA amplification ក៏អាចប្រើបច្ចេកវិទ្យា PCR transcription បញ្ច្រាសក៏ដោយ NASBA មានគុណសម្បត្តិផ្ទាល់ខ្លួនរបស់វា៖ វាអាចត្រូវបានអនុវត្តក្រោមលក្ខខណ្ឌសីតុណ្ហភាពថេរ ហើយវាមានស្ថេរភាព និងត្រឹមត្រូវជាងបច្ចេកវិទ្យា PCR ប្រពៃណី។

ប្រតិកម្មគឺនៅសីតុណ្ហភាព 41 អង្សាសេ ហើយតម្រូវឱ្យ AMV (មេរោគ myeloblastosis សត្វស្លាប) reverse transcriptase, RNase H, T7 RNA polymerase និង primers មួយគូដើម្បីបញ្ចប់។

ដំណើរការនេះរួមមានជាចម្បង៖

primer ឆ្ពោះទៅមុខមានលំដាប់បន្ថែមនៃកម្មវិធីផ្សព្វផ្សាយ T7 ។កំឡុងពេលប្រតិកម្ម សារធាតុ primer ភ្ជាប់ទៅខ្សែ RNA ហើយត្រូវបានបំប្លែងដោយអង់ស៊ីម AMV ដើម្បីបង្កើតជាខ្សែពីរ DNA-RNA ។

RNase H រំលាយ RNA ក្នុង hybrid double-strand និងរក្សា DNA ខ្សែតែមួយ។

នៅក្រោមសកម្មភាពនៃ primer បញ្ច្រាសនិងអង់ស៊ីម AMV ខ្សែ DNA ទ្វេរដងដែលមានលំដាប់ផ្សព្វផ្សាយ T7 ត្រូវបានបង្កើតឡើង។

នៅក្រោមសកម្មភាពរបស់ T7 RNA polymerase ដំណើរការចម្លងត្រូវបានបញ្ចប់ ហើយចំនួនដ៏ច្រើននៃ RNA គោលដៅត្រូវបានផលិត។

គុណសម្បត្តិរបស់ NASBA៖

(1) សារធាតុ primer របស់វាមានលំដាប់ផ្សព្វផ្សាយ T7 ប៉ុន្តែ DNA ខ្សែទ្វេបរទេសមិនមានលំដាប់ផ្សព្វផ្សាយ T7 និងមិនអាចពង្រីកបានទេ ដូច្នេះបច្ចេកវិទ្យានេះមានភាពជាក់លាក់ និងភាពប្រែប្រួលខ្ពស់។

(2) NASBA បញ្ចូលដោយផ្ទាល់នូវដំណើរការចម្លងបញ្ច្រាសទៅក្នុងប្រតិកម្ម amplification កាត់បន្ថយពេលវេលាប្រតិកម្ម។

គុណវិបត្តិនៃ NASBA៖

(1) សមាសធាតុប្រតិកម្មមានភាពស្មុគស្មាញជាង។

(2) អង់ស៊ីមបីប្រភេទត្រូវបានទាមទារដើម្បីធ្វើឱ្យប្រតិកម្មមានតម្លៃខ្ពស់។