ពេលវេលាពិត PCR ដែលត្រូវបានគេស្គាល់ផងដែរថាជា PCR បរិមាណឬ qPCR គឺជាវិធីសាស្រ្តសម្រាប់ការត្រួតពិនិត្យពេលវេលាជាក់ស្តែងនិងការវិភាគនៃផលិតផលពង្រីក PCR ។
ដោយសារតែ PCR បរិមាណមានគុណសម្បត្តិនៃប្រតិបត្តិការសាមញ្ញ រហ័ស និងងាយស្រួល ភាពប្រែប្រួលខ្ពស់ លទ្ធភាពធ្វើម្តងទៀតបានល្អ និងអត្រានៃការចម្លងរោគទាប វាត្រូវបានគេប្រើយ៉ាងទូលំទូលាយក្នុងការធ្វើតេស្តវេជ្ជសាស្រ្ត ការវាយតម្លៃប្រសិទ្ធភាពថ្នាំ ការស្រាវជ្រាវហ្សែន ការស្រាវជ្រាវប្តូរហ្សែន ការរកឃើញហ្សែន ការរកឃើញមេរោគ ការរកឃើញសត្វ និងរុក្ខជាតិ។ការធ្វើតេស្តអាហារ និងវិស័យផ្សេងៗទៀត។
ដូច្នេះហើយ មិនថាអ្នកកំពុងចូលរួមក្នុងការស្រាវជ្រាវជាមូលដ្ឋានក្នុងវិទ្យាសាស្ត្រជីវិត ឬបុគ្គលិកនៃក្រុមហ៊ុនឱសថ ក្រុមហ៊ុនបសុសត្វ ក្រុមហ៊ុនចំណីអាហារ ឬសូម្បីតែបុគ្គលិកនៃការិយាល័យត្រួតពិនិត្យ និងច្រកចេញចូល នាយកដ្ឋានត្រួតពិនិត្យបរិស្ថាន មន្ទីរពេទ្យ និងអង្គភាពផ្សេងទៀត អ្នកនឹងប្រឈមមុខនឹងការប៉ះពាល់ច្រើន ឬតិច ឬអ្នកត្រូវដឹងពីចំណេះដឹងនៃការគ្រប់គ្រង PCR បរិមាណ។

គោលការណ៍នៃ PCR ពេលវេលាពិត

Real Time PCR គឺជាវិធីសាស្រ្តមួយដែលសារធាតុ fluorescent ត្រូវបានបន្ថែមទៅក្នុងប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម PCR ហើយអាំងតង់ស៊ីតេនៃសញ្ញា fluorescence នៅក្នុងដំណើរការនៃប្រតិកម្ម PCR ត្រូវបានត្រួតពិនិត្យតាមពេលវេលាជាក់ស្តែងដោយឧបករណ៍ PCR បរិមាណ ហើយទីបំផុតទិន្នន័យពិសោធន៍ត្រូវបានវិភាគ និងដំណើរការ។

【ខ្សែកោងពង្រីក】គឺជាខ្សែកោងដែលពិពណ៌នាអំពីដំណើរការថាមវន្តនៃ PCR ។ខ្សែកោងពង្រីកនៃ PCR មិនមែនជាខ្សែកោងអិចស្ប៉ូណង់ស្យែលស្តង់ដារនោះទេ ប៉ុន្តែជាខ្សែកោង sigmoid ។

[ដំណាក់កាលវេទិកានៃខ្សែកោងពង្រីក]ជាមួយនឹងការកើនឡើងនៃចំនួនវដ្ត PCR ភាពអសកម្មនៃ DNA polymerase ការថយចុះនៃ dNTPs និង primers និងការរារាំងនៃប្រតិកម្មសំយោគដោយប្រតិកម្មដោយផលិតផល pyrophosphate ជាដើម PCR មិនតែងតែពង្រីកអិចស្ប៉ូណង់ស្យែលនោះទេ។ហើយនៅទីបំផុតនឹងចូលទៅក្នុងខ្ពង់រាបមួយ។

[តំបន់កំណើនអិចស្ប៉ូណង់ស្យែលនៃខ្សែកោងពង្រីក]ទោះបីជាដំណាក់កាលខ្ពង់រាបប្រែប្រួលយ៉ាងខ្លាំងក៏ដោយ នៅក្នុងតំបន់ជាក់លាក់មួយនៃតំបន់កំណើនអិចស្ប៉ូណង់ស្យែលនៃខ្សែកោងពង្រីក ភាពអាចធ្វើឡើងវិញបានគឺល្អណាស់ ដែលមានសារៈសំខាន់ខ្លាំងណាស់សម្រាប់ការវិភាគបរិមាណនៃ PCR ។

[តម្លៃកម្រិត និងតម្លៃ Ct]យើងកំណត់តម្លៃកំណត់នៃការរកឃើញ fluorescence នៅទីតាំងសមស្របនៅក្នុងតំបន់កំណើនអិចស្ប៉ូណង់ស្យែលនៃខ្សែកោង amplification គឺតម្លៃកម្រិត (Threshold)។ចំនុចប្រសព្វនៃតម្លៃកម្រិតចាប់ផ្ដើម និងខ្សែកោង amplification គឺជាតម្លៃ Ct ពោលគឺតម្លៃ Ct សំដៅលើចំនួនវដ្ត (Threshold Cycle) នៅពេលដែលតម្លៃកម្រិតត្រូវបានឈានដល់។

ក្រាហ្វខាងក្រោមបង្ហាញយ៉ាងច្បាស់ពីទំនាក់ទំនងរវាងបន្ទាត់កម្រិតចាប់ផ្ដើម និងខ្សែកោង amplification កម្រិតចាប់ផ្ដើម និងតម្លៃ Ct ។

【តើត្រូវគណនាដោយរបៀបណា?】

វាត្រូវបានបញ្ជាក់ដោយទ្រឹស្តីគណិតវិទ្យាថាតម្លៃ Ct មានទំនាក់ទំនងលីនេអ៊ែរបញ្ច្រាសជាមួយលោការីតនៃចំនួនគំរូដំបូង។ពេលវេលាពិត PCR ត្រួតពិនិត្យផលិតផលពង្រីក PCR ក្នុងពេលវេលាជាក់ស្តែង និងកំណត់បរិមាណពួកវាក្នុងដំណាក់កាលពង្រីកអិចស្ប៉ូណង់ស្យែល។

សម្រាប់វដ្តនីមួយៗនៃ PCR DNA កើនឡើងជាលំដាប់ 2 ដង ហើយមិនយូរប៉ុន្មានបានទៅដល់ខ្ពង់រាប។

សន្មតថាបរិមាណនៃ DNA ចាប់ផ្តើមគឺ A₀ បន្ទាប់ពីវដ្ត n បរិមាណទ្រឹស្តីនៃផលិតផល DNA អាចត្រូវបានបង្ហាញជា៖

A _n =A ₀ ×2ⁿ

បន្ទាប់មក បរិមាណ DNA ដំបូង A 0 កាន់តែច្រើន បរិមាណផលិតផលពង្រីកកាន់តែឆាប់ឈានដល់តម្លៃរាវរក An ហើយចំនួនវដ្តនៅពេលឈានដល់ An គឺជាតម្លៃ Ct ។នោះគឺបរិមាណ DNA ដំបូង A 0 កាន់តែច្រើន ខ្សែកោងពង្រីកមុននឹងឈានដល់កំពូល ហើយចំនួនវដ្តដែលត្រូវការ n គឺតូចជាង។

យើងអនុវត្តការបន្ថយកម្រិតជម្រាលនៃស្តង់ដារនៃការផ្តោតអារម្មណ៍ដែលគេស្គាល់ ហើយប្រើវាជាគំរូសម្រាប់ PCR ពេលវេលាពិត ហើយខ្សែកោងនៃការកើនឡើងជាបន្តបន្ទាប់នឹងត្រូវបានទទួលនៅចន្លោះពេលស្មើគ្នាក្នុងលំដាប់នៃការចាប់ផ្តើមចំនួន DNA ពីច្រើនទៅតិច។យោងតាមទំនាក់ទំនងលីនេអ៊ែររវាងតម្លៃ Ct និងលោការីតនៃចំនួនគំរូចាប់ផ្តើម ក[ខ្សែកោងស្តង់ដារ] អាចត្រូវបានបង្កើត។

ដោយការជំនួសតម្លៃ Ct នៃគំរូជាមួយនឹងការប្រមូលផ្តុំមិនស្គាល់ទៅក្នុងខ្សែកោងស្តង់ដារ បរិមាណគំរូដំបូងនៃគំរូជាមួយនឹងការផ្តោតអារម្មណ៍មិនស្គាល់អាចទទួលបាន ដែលជាគោលការណ៍បរិមាណនៃ PCR ពេលវេលាពិត។

វិធីសាស្រ្តនៃការរកឃើញ PCR ពេលវេលាពិត

ពេលវេលាពិត PCR រកឃើញផលិតផលពង្រីក PCR ដោយរកឃើញអាំងតង់ស៊ីតេ fluorescence នៅក្នុងប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម។

គោលការណ៍នៃវិធីសាស្រ្តបង្កប់ពណ៌ fluorescent】

ថ្នាំលាប fluorescentដូចជា TB Green ® អាចភ្ជាប់មិនជាក់លាក់ទៅនឹង DNA ពីរខ្សែនៅក្នុងប្រព័ន្ធ PCR និង fluoresce នៅពេលចង។

អាំងតង់ស៊ីតេ fluorescence នៅក្នុងប្រព័ន្ធប្រតិកម្មកើនឡើងជាលំដាប់ជាមួយនឹងការកើនឡើងនៃវដ្ត PCR ។តាមរយៈការរកឃើញអាំងតង់ស៊ីតេនៃហ្វ្លុយអូរីស បរិមាណនៃការពង្រីក DNA នៅក្នុងប្រព័ន្ធប្រតិកម្មអាចត្រូវបានត្រួតពិនិត្យក្នុងពេលវេលាជាក់ស្តែង ហើយបន្ទាប់មកបរិមាណនៃគំរូចាប់ផ្តើមនៅក្នុងគំរូអាចត្រូវបានប៉ាន់ប្រមាណបញ្ច្រាស។

【គោលការណ៍នៃការស៊ើបអង្កេត fluorescent】

ការស៊ើបអង្កេត fluorescentគឺ​ជា​លំដាប់​អាស៊ីត​នុយក្លេ​អ៊ីក​ជាមួយ​ក្រុម​ហ្វ្លុយ​រ៉េស​នៅ​ចុង 5′ និង​ក្រុម​ពន្លត់​នៅ​ចុង 3′ ដែល​អាច​ភ្ជាប់​យ៉ាង​ពិសេស​ទៅនឹង​គំរូ។នៅពេលដែលការស៊ើបអង្កេតនៅដដែលនោះ fluorescence ដែលបញ្ចេញដោយ fluorophore ត្រូវបានពន្លត់ដោយក្រុម quenching ហើយមិនអាច fluoresce បានទេ។នៅពេលដែលការស៊ើបអង្កេតត្រូវបាន decomposed សារធាតុ fluorescent នឹង dissociate និងបញ្ចេញ fluorescence ។

ការស៊ើបអង្កេត fluorescent ត្រូវបានបន្ថែមទៅដំណោះស្រាយប្រតិកម្ម PCR ។ក្នុងអំឡុងពេលដំណើរការ annealing ការស៊ើបអង្កេត fluorescent នឹងភ្ជាប់ទៅនឹងទីតាំងជាក់លាក់នៃគំរូ។ក្នុងអំឡុងពេលដំណើរការបន្ថែម សកម្មភាព 5′ → 3′ exonuclease នៃអង់ស៊ីម PCR អាច decompose fluorescent probe hybrided ជាមួយ template ហើយសារធាតុ fluorescent ត្រូវបាន dissociated ដើម្បីបញ្ចេញ fluorescent ។ដោយការរកឃើញអាំងតង់ស៊ីតេ fluorescence នៃការស៊ើបអង្កេតនៅក្នុងប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម គោលបំណងនៃការត្រួតពិនិត្យបរិមាណ amplification នៃផលិតផល PCR អាចសម្រេចបាន។

【ការជ្រើសរើសវិធីសាស្រ្តរាវរកពន្លឺ】

ប្រសិនបើវាត្រូវបានប្រើដើម្បីបែងចែកលំដាប់ជាមួយនឹងភាពដូចគ្នាខ្ពស់ និងអនុវត្តការរកឃើញ multiplex PCR ដូចជាការវិភាគការវាយ SNP នោះវិធីសាស្ត្រស៊ើបអង្កេត fluorescent គឺមិនអាចជំនួសបានទេ។
សម្រាប់ការពិសោធន៍ PCR ពេលវេលាពិតផ្សេងទៀត វិធីសាស្ត្រ fluorescent chimera ដ៏សាមញ្ញ ងាយស្រួល និងមានតម្លៃទាបអាចប្រើប្រាស់បាន។

ការស៊ើបអង្កេតជាក់លាក់ខ្លាំង មានសមត្ថភាព Multiplex PCR

កង្វះខាត

តម្រូវការជាក់លាក់ខ្ពស់សម្រាប់ការពង្រីក;

multiplex PCR មិន​អាច​ត្រូវ​បាន​អនុវត្ត​ត្រូវ​ការ​ដើម្បី​រចនា​ការ​ស៊ើបអង្កេត​ជាក់លាក់, តម្លៃ​ខ្ពស់;

ពេលខ្លះការរចនាការស៊ើបអង្កេតគឺពិបាក

ផលិតផលដែលពាក់ព័ន្ធ៖