តម្លៃ Ct គឺជាទម្រង់បង្ហាញលទ្ធផលដ៏សំខាន់បំផុតនៃ PCR បរិមាណ fluorescent ។វាត្រូវបានប្រើដើម្បីគណនាភាពខុសគ្នានៃការបញ្ចេញហ្សែន ឬលេខចម្លងហ្សែន។ដូច្នេះតើតម្លៃ Ct នៃបរិមាណ fluorescence ចាត់ទុកថាសមហេតុផល?តើធ្វើដូចម្តេចដើម្បីធានាបាននូវជួរដ៏មានប្រសិទ្ធិភាពនៃតម្លៃ Ct?
តើតម្លៃ Ct គឺជាអ្វី?
កំឡុងពេលដំណើរការពង្រីក qPCR ចំនួនដែលត្រូវគ្នានៃវដ្ដ amplification (Cycle Threshold) នៅពេលដែលសញ្ញា fluorescence នៃផលិតផល amplified ឈានដល់កម្រិត fluorescence ដែលបានកំណត់។C តំណាងឱ្យ Cycle និង T តំណាងឱ្យ Threshold ។និយាយឱ្យសាមញ្ញ តម្លៃ Ct គឺជាចំនួនវដ្តដែលត្រូវគ្នានឹងពេលដែលការពង្រីកគំរូដំបូងឈានដល់ចំនួនជាក់លាក់នៃផលិតផលនៅក្នុង qPCR ។អ្វីដែលគេហៅថា "បរិមាណជាក់លាក់នៃផលិតផល" នឹងត្រូវបានពន្យល់បន្ថែមនៅពេលក្រោយ។
តើតម្លៃ Ct ធ្វើអ្វី?
1.ទំនាក់ទំនងរវាងការពង្រីកអិចស្ប៉ូណង់ស្យែល ចំនួនគំរូ និងតម្លៃ Ct
តាមឧត្ដមគតិ ហ្សែននៅក្នុង qPCR ត្រូវបានប្រមូលផ្តុំដោយការពង្រីកអិចស្ប៉ូណង់ស្យែល បន្ទាប់ពីចំនួនជាក់លាក់នៃវដ្ត។ទំនាក់ទំនងរវាងចំនួនវដ្ដពង្រីកនិងបរិមាណផលិតផលគឺ៖ បរិមាណផលិតផលពង្រីក = បរិមាណគំរូដំបូង × (1+En) លេខវដ្ដ។ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយ ប្រតិកម្ម qPCR មិនតែងតែស្ថិតក្នុងស្ថានភាពដ៏ល្អនោះទេ។នៅពេលដែលបរិមាណផលិតផលពង្រីកឈានដល់ "ចំនួនផលិតផលជាក់លាក់" ចំនួននៃវដ្តនៅពេលនេះគឺជាតម្លៃ Ct ហើយវាស្ថិតនៅក្នុងរយៈពេលពង្រីកអិចស្ប៉ូណង់ស្យែល។ទំនាក់ទំនងរវាងតម្លៃ Ct និងចំនួននៃគំរូចាប់ផ្តើម៖ មានទំនាក់ទំនងលីនេអ៊ែររវាងតម្លៃ Ct នៃគំរូ និងលោការីតនៃលេខចម្លងចាប់ផ្តើមនៃគំរូ។ការប្រមូលផ្តុំគំរូដំបូងកាន់តែខ្ពស់ តម្លៃ Ct កាន់តែតូច។កំហាប់គំរូដំបូងទាប តម្លៃ Ct កាន់តែធំ។
2.Amplification curve, កម្រិតពន្លឺ fluorescence និងចំនួនផលិតផល PCR ជាក់លាក់
បរិមាណនៃផលិតផលពង្រីក qPCR ត្រូវបានបង្ហាញដោយផ្ទាល់ក្នុងទម្រង់នៃសញ្ញា fluorescent ពោលគឺខ្សែកោងពង្រីក។នៅដំណាក់កាលដំបូងនៃ PCR ការពង្រីកគឺស្ថិតនៅក្រោមលក្ខខណ្ឌដ៏ល្អ ចំនួននៃវដ្តគឺតូច ការប្រមូលផ្តុំផលិតផលគឺតូច ហើយកម្រិតនៃ fluorescence មិនអាចត្រូវបានសម្គាល់យ៉ាងច្បាស់ពីផ្ទៃខាងក្រោយ fluorescence នោះទេ។បន្ទាប់ពីនោះ fluorescence កើនឡើង ហើយចូលដំណាក់កាលអិចស្ប៉ូណង់ស្យែល។បរិមាណនៃផលិតផល PCR អាចត្រូវបានរកឃើញនៅចំណុចជាក់លាក់មួយ នៅពេលដែលប្រតិកម្ម PCR ស្ថិតក្នុងដំណាក់កាលអិចស្ប៉ូណង់ស្យែល ដែលអាចត្រូវបានប្រើជា "ចំនួនជាក់លាក់នៃផលិតផល" ហើយខ្លឹមសារដំបូងនៃគំរូអាចត្រូវបានកាត់ចេញពីនេះ។ដូច្នេះ អាំងតង់ស៊ីតេនៃសញ្ញា fluorescence ដែលត្រូវគ្នាទៅនឹងចំនួនជាក់លាក់នៃផលិតផល គឺជាកម្រិតពន្លឺ fluorescence ។
នៅដំណាក់កាលចុងក្រោយនៃ PCR ខ្សែកោង amplification លែងបង្ហាញការពង្រីកអិចស្ប៉ូណង់ស្យែល ហើយចូលទៅក្នុងដំណាក់កាលលីនេអ៊ែរ និងដំណាក់កាលខ្ពង់រាប។
3.Reproducibility នៃតម្លៃ Ct
នៅពេលដែលវដ្ត PCR ឈានដល់លេខវដ្តនៃតម្លៃ Ct វាទើបតែបានបញ្ចូលរយៈពេលពង្រីកអិចស្ប៉ូណង់ស្យែលពិត។នៅពេលនេះ កំហុសតូចតាចមិនត្រូវបានពង្រីកទេ ដូច្នេះការផលិតឡើងវិញនៃតម្លៃ Ct គឺល្អឥតខ្ចោះ ពោលគឺគំរូដូចគ្នាត្រូវបានពង្រីកនៅពេលផ្សេងគ្នា ឬក្នុងបំពង់ផ្សេងគ្នាក្នុងពេលតែមួយ។Amplification តម្លៃ Ct ដែលទទួលបានគឺថេរ។
1.Amplification efficiency En
ប្រសិទ្ធភាពពង្រីក PCR សំដៅទៅលើប្រសិទ្ធភាពដែលវត្ថុធាតុ polymerase បំប្លែងហ្សែនទៅជាអំព្លីកុន។ប្រសិទ្ធភាពនៃការពង្រីកនៅពេលដែលម៉ូលេគុល DNA មួយត្រូវបានបំលែងទៅជាម៉ូលេគុល DNA ពីរគឺ 100% ។ប្រសិទ្ធភាពនៃការពង្រីកត្រូវបានបង្ហាញជាទូទៅថាជា En ។ដើម្បីជួយសម្រួលដល់ការវិភាគនៃអត្ថបទជាបន្តបន្ទាប់ កត្តាដែលជះឥទ្ធិពលដល់ប្រសិទ្ធភាពនៃការពង្រីកត្រូវបានណែនាំដោយសង្ខេប។
| កត្តាដែលជះឥទ្ធិពល | ការពន្យល់ | តើត្រូវវិនិច្ឆ័យយ៉ាងដូចម្តេច? |
| A. ថ្នាំទប់ស្កាត់ PCR | 1. គំរូ DNA មានសារធាតុដែលរារាំងប្រតិកម្ម PCR ដូចជាប្រូតេអ៊ីន ឬសារធាតុសាប៊ូ។2. cDNA បន្ទាប់ពីការចម្លងបញ្ច្រាសមានកំហាប់ខ្ពស់នៃសមាសធាតុ RNA ឬ RT reagent គំរូដែលអាចរារាំងប្រតិកម្ម PCR ជាបន្តបន្ទាប់ផងដែរ។ | 1. ថាតើមានការបំពុលអាចត្រូវបានវិនិច្ឆ័យដោយការវាស់សមាមាត្រនៃ A260/A280 និង A260/A230 ឬ RNA electrophoresis ។2. ថាតើ cDNA ត្រូវបានពនឺតាមសមាមាត្រជាក់លាក់មួយបន្ទាប់ពីការចម្លងបញ្ច្រាស។ |
| ខ. ការរចនាបឋមមិនត្រឹមត្រូវ | ថ្នាំ primers មិនមានប្រសិទ្ធភាពទេ។ | ពិនិត្យថ្នាំ primers សម្រាប់ primer-dimers ឬ hairpins ភាពមិនស៊ីគ្នា ហើយជួនកាលវាលាតសន្ធឹងការរចនា intronic។ |
| គ. ការរចនាកម្មវិធីប្រតិកម្ម PCR មិនត្រឹមត្រូវ | 1. ថ្នាំ primers មិនអាចលាបបានយ៉ាងមានប្រសិទ្ធភាព2. ការបញ្ចេញ DNA polymerase មិនគ្រប់គ្រាន់ 3. សីតុណ្ហភាពខ្ពស់រយៈពេលវែង សកម្មភាព DNA polymerase មានការថយចុះ | 1. សីតុណ្ហភាព annealing គឺខ្ពស់ជាងតម្លៃ TM នៃ primer2. ពេលវេលាមុនពេល denaturation គឺខ្លីពេក 3. ពេលវេលានៃដំណាក់កាលនីមួយៗនៃនីតិវិធីប្រតិកម្មគឺវែងពេក |
| ឃ. ការលាយមិនគ្រប់គ្រាន់នៃសារធាតុប្រតិកម្ម ឬកំហុសក្នុងការដាក់បំពង់ | នៅក្នុងប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម កំហាប់មូលដ្ឋាននៃសមាសធាតុប្រតិកម្ម PCR គឺខ្ពស់ពេក ឬមិនស្មើគ្នា ដែលបណ្តាលឱ្យមានការពង្រីកមិនមែននិទស្សន្តនៃ PCR amplification | |
| E. ប្រវែងអំពែក | ប្រវែងនៃ amplicon វែងពេក លើសពី 300bp ហើយប្រសិទ្ធភាព amplification ទាប | ពិនិត្យមើលថាប្រវែង amplicon ស្ថិតនៅចន្លោះ 80-300bp |
| F. ឥទ្ធិពលនៃសារធាតុ qPCR | កំហាប់ DNA polymerase នៅក្នុង reagent មានកម្រិតទាប ឬកំហាប់អ៊ីយ៉ុងនៅក្នុងសតិបណ្ដោះអាសន្នមិនត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរទេ ដែលបណ្តាលឱ្យសកម្មភាពអង់ស៊ីម Taq មិនឈានដល់កម្រិតអតិបរមា។ | ការកំណត់ប្រសិទ្ធភាពពង្រីកដោយខ្សែកោងស្តង់ដារ |
2.Range នៃតម្លៃ Ct
តម្លៃ Ct មានចាប់ពី 15-35។ប្រសិនបើតម្លៃ Ct តិចជាង 15 វាត្រូវបានគេចាត់ទុកថា amplification ស្ថិតនៅក្នុងចន្លោះនៃរយៈពេលបន្ទាត់មូលដ្ឋាន ហើយកម្រិត fluorescence មិនត្រូវបានឈានដល់។តាមឧត្ដមគតិ មានទំនាក់ទំនងលីនេអ៊ែររវាងតម្លៃ Ct និងលោការីតនៃលេខចម្លងដំបូងនៃគំរូ នោះគឺជាខ្សែកោងស្តង់ដារ។តាមរយៈខ្សែកោងស្ដង់ដារ នៅពេលដែលប្រសិទ្ធភាព amplification គឺ 100% តម្លៃ Ct ដែលបានគណនាសម្រាប់កំណត់ចំនួនលេខចម្លងតែមួយនៃហ្សែនគឺនៅជុំវិញ 35។ ប្រសិនបើវាធំជាង 35 នោះលេខច្បាប់ចម្លងដំបូងនៃគំរូគឺតិចជាង 1 ដែលអាចចាត់ទុកថាគ្មានន័យ។
សម្រាប់ជួរហ្សែន Ct ផ្សេងៗគ្នា ដោយសារភាពខុសគ្នានៃចំនួនចម្លងហ្សែន និងប្រសិទ្ធភាពពង្រីកក្នុងបរិមាណគំរូដំបូង វាចាំបាច់ក្នុងការធ្វើខ្សែកោងស្តង់ដារសម្រាប់ហ្សែន និងគណនាជួររកឃើញលីនេអ៊ែរនៃហ្សែន។
3. កត្តាឥទ្ធិពលនៃតម្លៃ Ct
ពីទំនាក់ទំនងរវាងចំនួននៃវដ្ត amplification និងបរិមាណផលិតផល៖ បរិមាណផលិតផល amplified = ចំនួននៃគំរូដំបូង × (1+En) cycle number វាអាចត្រូវបានគេមើលឃើញថានៅក្រោមលក្ខខណ្ឌដ៏ល្អ បរិមាណនៃ template ដំបូង និង En នឹងមានផលប៉ះពាល់អវិជ្ជមានលើតម្លៃ Ct ត្រូវបានប៉ះពាល់។ភាពខុសគ្នានៃគុណភាពគំរូ ឬប្រសិទ្ធភាពពង្រីកនឹងធ្វើឱ្យតម្លៃ Ct ធំពេក ឬតូចពេក។
តម្លៃ 4.Ct ធំពេក ឬតូចពេក
ពេលវេលាបង្ហោះ៖ ថ្ងៃទី ២២ ខែកុម្ភៈ ឆ្នាំ ២០២៣
