បច្ចេកវិទ្យាវិភាគម៉ូលេគុលប្រើវិធីសាស្ត្រជីវវិទ្យាម៉ូលេគុលដើម្បីរកមើលការបង្ហាញ និងរចនាសម្ព័ន្ធនៃសម្ភារៈហ្សែននៃរាងកាយមនុស្ស និងធាតុបង្កជំងឺផ្សេងៗ ដើម្បីសម្រេចបាននូវគោលបំណងនៃការទស្សន៍ទាយ និងការធ្វើរោគវិនិច្ឆ័យជំងឺ។

ក្នុងប៉ុន្មានឆ្នាំថ្មីៗនេះ ជាមួយនឹងការធ្វើឱ្យប្រសើរឡើង និងការធ្វើឡើងវិញនៃបច្ចេកវិទ្យាវិភាគម៉ូលេគុល ការអនុវត្តគ្លីនិកនៃការវិនិច្ឆ័យម៉ូលេគុលកាន់តែទូលំទូលាយ និងស៊ីជម្រៅ ហើយទីផ្សារវិភាគម៉ូលេគុលបានឈានចូលដល់ដំណាក់កាលនៃការអភិវឌ្ឍន៍យ៉ាងឆាប់រហ័ស។

អ្នកនិពន្ធសង្ខេបអំពីបច្ចេកវិទ្យាវិភាគម៉ូលេគុលទូទៅនៅលើទីផ្សារ ហើយចែកចេញជាបីផ្នែក៖ ផ្នែកទីមួយណែនាំបច្ចេកវិទ្យា PCR ផ្នែកទីពីរណែនាំបច្ចេកវិទ្យា amplification isothermal acid nucleic acid និងផ្នែកទីពីរណែនាំបច្ចេកវិទ្យា sequencing ។

01

ផ្នែកទី 1: បច្ចេកវិទ្យា PCR

បច្ចេកវិទ្យា PCR

PCR (ប្រតិកម្មខ្សែសង្វាក់វត្ថុធាតុ polymerase) គឺជាបច្ចេកវិទ្យាពង្រីក DNA ក្នុង vitro ដែលមានប្រវត្តិជាង 30 ឆ្នាំ។

បច្ចេកវិទ្យា PCR ត្រូវបានត្រួសត្រាយនៅឆ្នាំ 1983 ដោយ Kary Mullis នៃ Cetus សហរដ្ឋអាមេរិក។Mullis បានដាក់ពាក្យសុំប៉ាតង់ PCR ក្នុងឆ្នាំ 1985 ហើយបានបោះពុម្ពក្រដាសសិក្សា PCR ដំបូងបង្អស់លើវិទ្យាសាស្រ្តក្នុងឆ្នាំដដែល។Mullis បានឈ្នះរង្វាន់ណូបែលគីមីវិទ្យាក្នុងឆ្នាំ 1993 ។

គោលការណ៍ជាមូលដ្ឋាននៃ PCR

PCR អាចពង្រីកបំណែក DNA គោលដៅបានច្រើនជាងមួយលានដង។គោលការណ៍គឺថានៅក្រោមកាតាលីករនៃ DNA polymerase ខ្សែ DNA មេត្រូវបានប្រើជាគំរូ ហើយ primer ជាក់លាក់មួយត្រូវបានប្រើជាចំណុចចាប់ផ្តើមសម្រាប់ផ្នែកបន្ថែម។វាត្រូវបានចម្លងនៅក្នុង vitro តាមរយៈជំហានដូចជា denaturation, annealing និង extension ។ដំណើរ​ការ​នៃ DNA របស់​កូន​ស្រី​ដែល​បំពេញ​បន្ថែម​ទៅ​នឹង​គំរូ DNA របស់​មេ។

ដំណើរការ PCR ស្តង់ដារត្រូវបានបែងចែកជាបីដំណាក់កាល៖

1. Denaturation: ប្រើសីតុណ្ហភាពខ្ពស់ដើម្បីបំបែក DNA ទ្វេរដង។ចំណងអ៊ីដ្រូសែនរវាងខ្សែ DNA ទ្វេត្រូវបានបំបែកនៅសីតុណ្ហភាពខ្ពស់ (93-98 ° C) ។

2. Annealing: បន្ទាប់ពី DNA ពីរខ្សែត្រូវបានបំបែក សីតុណ្ហភាពត្រូវបានបន្ទាប ដូច្នេះ primer អាចភ្ជាប់ទៅនឹង DNA ខ្សែតែមួយ។

3. ផ្នែកបន្ថែម: DNA polymerase ចាប់ផ្តើមសំយោគ strands បំពេញតាម DNA strands ពី primers ចងនៅពេលដែលសីតុណ្ហភាពត្រូវបានបន្ទាប។នៅពេលដែលផ្នែកបន្ថែមត្រូវបានបញ្ចប់ វដ្តមួយត្រូវបានបញ្ចប់ ហើយចំនួននៃបំណែក DNA កើនឡើងទ្វេដង។

ការធ្វើឡើងវិញនូវជំហានទាំងបីនេះ 25-35 ដង ចំនួននៃបំណែក DNA នឹងកើនឡើងជាលំដាប់។

ភាពប៉ិនប្រសប់នៃ PCR គឺថា primers ផ្សេងគ្នាអាចត្រូវបានរចនាឡើងសម្រាប់ហ្សែនគោលដៅផ្សេងគ្នា ដូច្នេះបំណែកហ្សែនគោលដៅអាចត្រូវបានពង្រីកក្នុងរយៈពេលដ៏ខ្លី។

រហូតមកដល់ពេលនេះ PCR អាចត្រូវបានបែងចែកជាបីប្រភេទគឺ PCR ធម្មតា PCR បរិមាណ fluorescent និង PCR ឌីជីថល។

ជំនាន់ដំបូងនៃ PCR ធម្មតា។

ប្រើឧបករណ៍ពង្រីក PCR ធម្មតា ដើម្បីពង្រីកហ្សែនគោលដៅ ហើយបន្ទាប់មកប្រើ electrophoresis gel agarose ដើម្បីរកឃើញផលិតផល មានតែការវិភាគគុណភាពប៉ុណ្ណោះដែលអាចធ្វើបាន។

គុណវិបត្តិចម្បងនៃ PCR ជំនាន់ទី 1:

- ងាយនឹងការពង្រីកមិនជាក់លាក់ និងលទ្ធផលវិជ្ជមានមិនពិត។

- ការរកឃើញត្រូវចំណាយពេលយូរ ហើយប្រតិបត្តិការគឺពិបាក។

- មានតែការធ្វើតេស្តគុណភាពប៉ុណ្ណោះដែលអាចធ្វើបាន។

PCR បរិមាណ fluorescence ជំនាន់ទីពីរ

PCR បរិមាណ Fluorescence (Real-Time PCR) ដែលគេស្គាល់ថាជា qPCR ត្រូវបានប្រើដើម្បីតាមដានការប្រមូលផ្តុំនៃផលិតផល amplified តាមរយៈការប្រមូលផ្តុំនៃសញ្ញា fluorescent ដោយបន្ថែមការស៊ើបអង្កេត fluorescent ដែលអាចបង្ហាញពីវឌ្ឍនភាពនៃប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម និងដើម្បីវិនិច្ឆ័យលទ្ធផលតាមរយៈខ្សែកោង fluorescence ហើយវាអាចត្រូវបានកំណត់បរិមាណនៃតម្លៃ និងស្តង់ដារ។

ដោយសារតែបច្ចេកវិទ្យា qPCR ត្រូវបានអនុវត្តនៅក្នុងប្រព័ន្ធបិទជិត ប្រូបាប៊ីលីតេនៃការចម្លងរោគត្រូវបានកាត់បន្ថយ ហើយសញ្ញា fluorescence អាចត្រូវបានត្រួតពិនិត្យសម្រាប់ការរកឃើញបរិមាណ ដូច្នេះវាត្រូវបានប្រើប្រាស់យ៉ាងទូលំទូលាយបំផុតក្នុងការអនុវត្តគ្លីនិក ហើយបានក្លាយជាបច្ចេកវិទ្យាលេចធ្លោនៅក្នុង PCR ។

សារធាតុ fluorescent ដែលប្រើក្នុង PCR បរិមាណ fluorescent ពេលវេលាពិតអាចត្រូវបានបែងចែកជាៈ TaqMan fluorescent probes ម៉ូលេគុល beacons និង fluorescent dyes ។

1) ការស៊ើបអង្កេត fluorescent TaqMan:

កំឡុងពេលពង្រីក PCR ការស៊ើបអង្កេត fluorescent ជាក់លាក់មួយត្រូវបានបន្ថែមខណៈពេលដែលបន្ថែម primers មួយគូ។ការស៊ើបអង្កេតគឺជា oligonucleotide ហើយចុងទាំងពីរត្រូវបានដាក់ស្លាករៀងគ្នាជាមួយនឹងក្រុម fluorescent អ្នករាយការណ៍ និងក្រុម quencher fluorescent ។

នៅពេលដែលការស៊ើបអង្កេតគឺនៅដដែល សញ្ញា fluorescent បញ្ចេញដោយក្រុមអ្នករាយការណ៍ត្រូវបានស្រូបយកដោយក្រុម quenching;កំឡុងពេលពង្រីក PCR សកម្មភាព exonuclease 5′-3′ នៃអង់ស៊ីម Taq កាត់ និងបន្ថយការស៊ើបអង្កេត ធ្វើឱ្យក្រុម fluorescent អ្នករាយការណ៍ និង quencher ក្រុម fluorescent ត្រូវបានបំបែកចេញ ដូច្នេះប្រព័ន្ធត្រួតពិនិត្យ fluorescence អាចទទួលបានសញ្ញា fluorescence ពោលគឺរាល់ពេលដែល DNA strand ត្រូវបានពង្រីក fluorescent ម៉ូលេគុលគឺជាសញ្ញាមួយ។ ធ្វើសមកាលកម្មទាំងស្រុងជាមួយនឹងការបង្កើតផលិតផល PCR ។

2) SYBR fluorescent dyes:

នៅក្នុងប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម PCR លើសពី SYBR fluorescent dye ត្រូវបានបន្ថែម។បន្ទាប់ពី SYBR fluorescent dye មិនត្រូវបានដាក់បញ្ចូលក្នុង DNA double-strand វាបញ្ចេញសញ្ញា fluorescent ។ម៉ូលេគុលថ្នាំជ្រលក់ SYBR ដែលមិនត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុងខ្សែសង្វាក់នឹងមិនបញ្ចេញសញ្ញា fluorescent ណាមួយឡើយ ដោយហេតុនេះធានាបាននូវសញ្ញា fluorescent ការកើនឡើងនៃផលិតផល PCR ត្រូវបានធ្វើសមកាលកម្មទាំងស្រុងជាមួយនឹងការកើនឡើងនៃផលិតផល PCR ។SYBR ភ្ជាប់ទៅនឹង DNA ពីរខ្សែប៉ុណ្ណោះ ដូច្នេះខ្សែកោងរលាយអាចត្រូវបានប្រើដើម្បីកំណត់ថាតើប្រតិកម្ម PCR ជាក់លាក់ឬអត់។

3) សញ្ញាម៉ូលេគុល

វាគឺជាការស៊ើបអង្កេត oligonucleotide ដែលមានស្លាកពីរដង stem-loop ដែលបង្កើតជារចនាសម្ព័ន្ធរបស់ hairpin ប្រហែល 8 bases នៅចុង 5 និង 3 ។លំដាប់នៃអាស៊ីត nucleic នៅចុងទាំងពីរត្រូវបានផ្គូផ្គងបំពេញគ្នា ដែលបណ្តាលឱ្យក្រុម fluorescent និងក្រុម quenching តឹង។បិទ វានឹងមិនបង្កើត fluorescence ទេ។

បន្ទាប់ពីផលិតផល PCR ត្រូវបានបង្កើត ក្នុងអំឡុងពេលដំណើរការ annealing ផ្នែកកណ្តាលនៃម៉ូលេគុល beacon ត្រូវបានផ្គូផ្គងជាមួយនឹងលំដាប់ DNA ជាក់លាក់មួយ ហើយហ្សែន fluorescent ត្រូវបានបំបែកចេញពីហ្សែន quencher ដើម្បីបង្កើត fluorescence ។

គុណវិបត្តិចម្បងនៃ PCR ជំនាន់ទីពីរ:

ភាពរសើបនៅតែខ្វះខាត ហើយការរកឃើញគំរូចម្លងទាបគឺមិនត្រឹមត្រូវទេ។

មានឥទ្ធិពលលើតម្លៃផ្ទៃខាងក្រោយ ហើយលទ្ធផលគឺងាយនឹងមានការជ្រៀតជ្រែក។

PCR ឌីជីថលជំនាន់ទីបី

ឌីជីថល PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) គណនាលេខចម្លងនៃលំដាប់គោលដៅតាមរយៈការរកឃើញចំណុចបញ្ចប់ ហើយអាចធ្វើការរកឃើញបរិមាណពិតប្រាកដដោយមិនចាំបាច់ប្រើការគ្រប់គ្រងខាងក្នុង និងខ្សែកោងស្តង់ដារ។

ឌីជីថល PCR ប្រើការរកឃើញចំណុចបញ្ចប់ និងមិនអាស្រ័យលើតម្លៃ Ct (កម្រិតនៃវដ្ត) ដូច្នេះប្រតិកម្ម PCR ឌីជីថលត្រូវបានរងផលប៉ះពាល់តិចជាងដោយប្រសិទ្ធភាពពង្រីក ហើយការអត់ធ្មត់ចំពោះប្រតិកម្ម PCR inhibitors ត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរឡើង ជាមួយនឹងភាពត្រឹមត្រូវខ្ពស់ និងការផលិតឡើងវិញ។

ដោយសារតែលក្ខណៈនៃភាពប្រែប្រួលខ្ពស់ និងភាពត្រឹមត្រូវខ្ពស់ វាមិនត្រូវបានជ្រៀតជ្រែកយ៉ាងងាយស្រួលដោយថ្នាំទប់ស្កាត់ប្រតិកម្ម PCR ទេ ហើយវាអាចសម្រេចបាននូវបរិមាណពិតប្រាកដដោយគ្មានផលិតផលស្តង់ដារ ដែលបានក្លាយជាចំណុចក្តៅនៃការស្រាវជ្រាវ និងកម្មវិធី។

យោងតាមទម្រង់ផ្សេងគ្នានៃអង្គភាពប្រតិកម្ម វាអាចបែងចែកជាបីប្រភេទគឺ ប្រព័ន្ធមីក្រូហ្វ្លុយឌីក បន្ទះឈីប និងប្រព័ន្ធដំណក់ទឹក។