មួយ, បង្កើនភាពប្រែប្រួលនៃប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម:

1. ញែក RNA ដែលមានគុណភាពខ្ពស់៖

ការសំយោគ cDNA ជោគជ័យបានមកពី RNA ដែលមានគុណភាពខ្ពស់។RNA ដែលមានគុណភាពខ្ពស់យ៉ាងហោចណាស់គួរតែមានប្រវែងពេញ និងមិនមានថ្នាំទប់ស្កាត់ការចម្លងបញ្ច្រាសដូចជា EDTA ឬ SDS ។គុណភាពនៃ RNA កំណត់ចំនួនអតិបរមានៃព័ត៌មានលំដាប់ដែលអ្នកអាចចម្លងទៅជា cDNA ។វិធីសាស្រ្តបន្សុត RNA ទូទៅគឺជាវិធីសាស្រ្តមួយជំហានដោយប្រើ guanidine isothiocyanate/acid phenol ។ដើម្បីទប់ស្កាត់ការចម្លងរោគដោយបរិមាណដាននៃ RNase RNA ដាច់ដោយឡែកពីសំណាកសម្បូរ RNase (ដូចជាលំពែង) ចាំបាច់ត្រូវរក្សាទុកក្នុងទម្រង់ formaldehyde ដើម្បីរក្សា RNA ដែលមានគុណភាពខ្ពស់ ជាពិសេសសម្រាប់ការរក្សាទុករយៈពេលវែង។RNA ស្រង់ចេញពីថ្លើមកណ្តុរត្រូវបានបង្ខូចទ្រង់ទ្រាយជាមូលដ្ឋានបន្ទាប់ពីត្រូវបានរក្សាទុកក្នុងទឹករយៈពេលមួយសប្តាហ៍ ខណៈដែល RNA ចម្រាញ់ចេញពីលំពែងរបស់កណ្តុរនៅតែមានស្ថេរភាពបន្ទាប់ពីត្រូវបានរក្សាទុកក្នុងទឹកអស់រយៈពេល 3 ឆ្នាំ។លើសពីនេះទៀត ប្រតិចារឹកវែងជាង 4 kb គឺមានភាពរសើបចំពោះការរិចរិលដោយ RNases ដានជាងប្រតិចារិកតូចៗ។ដើម្បីបង្កើនស្ថេរភាពនៃសំណាក RNA ដែលត្រូវបានរក្សាទុក RNA អាចត្រូវបានរំលាយនៅក្នុង deionized formamide និងរក្សាទុកនៅ -70 ° C ។Formamide ដែលប្រើដើម្បីរក្សា RNA ត្រូវតែគ្មានកំទេចកំទី RNA-degrading ។RNA ពីលំពែងអាចត្រូវបានរក្សាទុកក្នុងទម្រង់ម៉ាមីតយ៉ាងហោចណាស់មួយឆ្នាំ។នៅពេលរៀបចំប្រើ RNA អ្នកអាចប្រើវិធីសាស្រ្តខាងក្រោមដើម្បី precipitate RNA: បន្ថែម NaCl ទៅ 0.2M និង 4 ដងនៃបរិមាណអេតាណុល ទុកនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ 3-5 នាទី និង centrifuge នៅ 10,000 × g រយៈពេល 5 នាទី។

2. ប្រើ RNaseH-inactive (RNaseH-) reverse transcriptase:

ថ្នាំ RNase inhibitors ត្រូវបានបន្ថែមជាញឹកញាប់ទៅនឹងប្រតិកម្មចម្លងបញ្ច្រាសដើម្បីបង្កើនរយៈពេល និងទិន្នផលនៃការសំយោគ cDNA ។ថ្នាំ RNase inhibitors គួរតែត្រូវបានបន្ថែមកំឡុងពេលប្រតិកម្មសំយោគខ្សែទី 1 នៅក្នុងវត្តមាននៃសតិបណ្ដោះអាសន្ន និងភ្នាក់ងារកាត់បន្ថយ (ដូចជា DTT) ពីព្រោះដំណើរការមុនការសំយោគ cDNA ធ្វើឱ្យខូចមុខងារ inhibitor ដោយហេតុនេះបញ្ចេញ RNase ដែលអាចបង្ខូច RNA ។Protein RNase inhibitors គ្រាន់តែការពារការរិចរិលនៃ RNA ដោយ RNase A, B, C ហើយកុំការពារ RNase នៅលើស្បែក ដូច្នេះត្រូវប្រយ័ត្នកុំណែនាំ RNase ពីម្រាមដៃរបស់អ្នក ទោះបីប្រើថ្នាំទប់ស្កាត់ទាំងនេះក៏ដោយ។

Reverse transcriptase ជំរុញការបំប្លែង RNA ទៅ cDNA ។ទាំង M-MLV និង AMV មានសកម្មភាព RNaseH endogenous បន្ថែមពីលើសកម្មភាព polymerase ផ្ទាល់របស់ពួកគេ។សកម្មភាព RNaseH និងសកម្មភាព polymerase ប្រកួតប្រជែងគ្នាទៅវិញទៅមកសម្រាប់ខ្សែកូនកាត់ដែលបង្កើតឡើងរវាងគំរូ RNA និងខ្សែ DNA primer ឬ cDNA extension strand និងធ្វើឱ្យខូចខ្សែ RNA នៅក្នុង RNA:DNA complex។គំរូ RNA ដែលត្រូវបានបង្ខូចដោយសកម្មភាព RNaseH មិនអាចបម្រើជាស្រទាប់ខាងក្រោមដ៏មានប្រសិទ្ធភាពសម្រាប់ការសំយោគ cDNA ដែលកាត់បន្ថយទិន្នផល និងរយៈពេលនៃការសំយោគ cDNA ។ដូច្នេះ វានឹងមានប្រយោជន៍ក្នុងការលុបបំបាត់ ឬកាត់បន្ថយយ៉ាងខ្លាំងនូវសកម្មភាព RNaseH នៃ reverse transcriptase..

SuperScript Ⅱ reverse transcriptase, RNaseH- MMLV reverse transcriptase និង thermoScript reverse transcriptase, RNaseH- AMV អាចទទួលបានចំនួនច្រើន និង cDNA ប្រវែងពេញជាង MMLV និង AMV ។ភាពប្រែប្រួល RT-PCR នឹងត្រូវបានប៉ះពាល់ដោយបរិមាណនៃការសំយោគ cDNA ។ThermoScript គឺមានភាពរសើបជាង AMV ។ទំហំនៃផលិតផល RT-PCR ត្រូវបានកំណត់ដោយសមត្ថភាពនៃ transcriptase បញ្ច្រាសដើម្បីសំយោគ cDNA ជាពិសេសនៅពេលក្លូន cDNAs ធំជាង។បើប្រៀបធៀបជាមួយ MMLV SuperScripⅡបានបង្កើនទិន្នផលនៃផលិតផល RT-PCR ដ៏យូរ។RNaseH-reverse transcriptase ក៏មានការកើនឡើងនូវកម្តៅផងដែរ ដូច្នេះប្រតិកម្មអាចត្រូវបានអនុវត្តនៅសីតុណ្ហភាពខ្ពស់ជាងធម្មតា 37-42°C។នៅក្រោមលក្ខខណ្ឌសំយោគដែលបានស្នើ ប្រើ primer oligo(dT) និង 10 μCi នៃ [α-P]dCTP ។ទិន្នផលសរុបនៃខ្សែទីមួយត្រូវបានគណនាដោយប្រើវិធីសាស្ត្រទឹកភ្លៀង TCA ។cDNA ប្រវែងពេញត្រូវបានវិភាគដោយប្រើក្រុមតន្រ្តីដែលតម្រៀបតាមទំហំដែលកាត់ចេញ និងរាប់នៅលើជែល agarose អាល់កាឡាំង។

3. បង្កើនសីតុណ្ហភាព incubation សម្រាប់ការចម្លងបញ្ច្រាស៖

សីតុណ្ហភាព incubation ខ្ពស់ជួយបើករចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំ RNA បង្កើនទិន្នផលនៃប្រតិកម្ម។សម្រាប់គំរូ RNA ភាគច្រើន ការភ្ញាស់ RNA និង primers នៅសីតុណ្ហភាព 65°C ដោយគ្មានសតិបណ្ដោះអាសន្ន ឬអំបិល បន្ទាប់មកការត្រជាក់យ៉ាងលឿននៅលើទឹកកកនឹងលុបបំបាត់រចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំភាគច្រើន និងអនុញ្ញាតឱ្យ primers ចង។ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយ គំរូខ្លះនៅតែមានរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំ សូម្បីតែបន្ទាប់ពីការប្រែពណ៌។ការពង្រីកគំរូដ៏លំបាកទាំងនេះអាចត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើ ThermoScript Reverse Transcriptase និងដាក់ប្រតិកម្មប្រតិចារិកបញ្ច្រាសនៅសីតុណ្ហភាពខ្ពស់ជាង ដើម្បីកែលម្អការពង្រីក។សីតុណ្ហភាព incubation ខ្ពស់ក៏អាចបង្កើនភាពជាក់លាក់ផងដែរ ជាពិសេសនៅពេលដែលថ្នាំ primers ជាក់លាក់នៃហ្សែន (GSP) ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការសំយោគ cDNA (សូមមើលជំពូកទី 3)។ប្រសិនបើប្រើ GSP សូមប្រាកដថា Tm នៃ primers គឺដូចគ្នាទៅនឹងសីតុណ្ហភាព incubation ដែលរំពឹងទុក។កុំប្រើ oligo (dT) និង primers ចៃដន្យលើសពី 60 ° C ។ថ្នាំ primers ចៃដន្យត្រូវការ incubation នៅ 25 ° C សម្រាប់ 10 នាទីមុនពេលកើនឡើងដល់ 60 ° C ។បន្ថែមពីលើការប្រើសីតុណ្ហភាពប្រតិចារិកបញ្ច្រាសខ្ពស់ ភាពជាក់លាក់ក៏អាចប្រសើរឡើងដោយការផ្ទេរដោយផ្ទាល់នូវល្បាយ RNA/primer ពីសីតុណ្ហភាព denaturation 65°C ទៅសីតុណ្ហភាព incubation transcription បញ្ច្រាស និងបន្ថែមល្បាយប្រតិកម្ម 2× ដែលក្តៅមុន (cDNA hot-start synthesis)។វិធីសាស្រ្តនេះជួយការពារការផ្គូផ្គងមូលដ្ឋានអន្តរម៉ូលេគុលដែលកើតឡើងនៅសីតុណ្ហភាពទាប។ការផ្លាស់ប្តូរសីតុណ្ហភាពច្រើនដែលត្រូវការសម្រាប់ RT-PCR អាចត្រូវបានធ្វើឱ្យសាមញ្ញដោយប្រើម៉ាស៊ីនកំដៅ។

Tth thermostable polymerase ដើរតួជា DNA polymerase នៅក្នុងវត្តមានរបស់ Mg2+ និងជា RNA polymerase នៅក្នុងវត្តមានរបស់ Mn2+ ។វាអាចត្រូវបានរក្សាកំដៅនៅសីតុណ្ហភាពអតិបរមា 65 អង្សាសេ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ វត្តមានរបស់ Mn2+ ក្នុងអំឡុងពេល PCR កាត់បន្ថយភាពស្មោះត្រង់ ដែលធ្វើឱ្យ Tth polymerase មិនសូវសមរម្យសម្រាប់ការពង្រីកភាពជាក់លាក់ខ្ពស់ ដូចជាការក្លូន cDNA ជាដើម។លើសពីនេះ Tth មានប្រសិទ្ធភាពការចម្លងបញ្ច្រាសទាប ដែលកាត់បន្ថយភាពប្រែប្រួល ហើយចាប់តាំងពីការចម្លងបញ្ច្រាស និង PCR អាចត្រូវបានអនុវត្តជាមួយនឹងអង់ស៊ីមតែមួយ ប្រតិកម្មគ្រប់គ្រងដោយគ្មានការចម្លងបញ្ច្រាសមិនអាចប្រើដើម្បីប្រៀបធៀបផលិតផលពង្រីក cDNA ជាមួយ DNA ហ្សែនដែលបំពុល។ផលិតផលពង្រីកត្រូវបានបំបែក។

4. សារធាតុបន្ថែមដែលជំរុញការចម្លងបញ្ច្រាស៖

សារធាតុបន្ថែមរួមទាំង glycerol និង DMSO ត្រូវបានបន្ថែមទៅក្នុងប្រតិកម្មសំយោគនៃខ្សែទីមួយ ដែលអាចកាត់បន្ថយស្ថេរភាពនៃអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីកពីរខ្សែ និងបំបែករចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំនៃ RNA ។រហូតដល់ទៅ 20% glycerol ឬ 10% DMSO អាចត្រូវបានបន្ថែមដោយមិនប៉ះពាល់ដល់សកម្មភាព SuperScript II ឬ MMLV ។AMV ក៏អាចទ្រាំទ្របានរហូតដល់ 20% glycerol ដោយមិនបាត់បង់សកម្មភាព។ដើម្បីបង្កើនភាពប្រែប្រួលនៃ RT-PCR នៅក្នុងប្រតិកម្មប្រតិចារិកបញ្ច្រាស SuperScriptⅡ គ្លីសេរីន 10% អាចត្រូវបានបន្ថែម និងភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាព 45°C។ប្រសិនបើ 1/10 នៃផលិតផលប្រតិកម្មបញ្ច្រាសត្រូវបានបន្ថែមទៅ PCR នោះកំហាប់នៃ glycerol ក្នុងប្រតិកម្ម amplification គឺ 0.4% ដែលមិនគ្រប់គ្រាន់ដើម្បីរារាំង PCR ។

5. ការព្យាបាល RNaseH៖

ការព្យាបាលប្រតិកម្មសំយោគ cDNA ជាមួយ RNaseH មុនពេល PCR អាចបង្កើនភាពប្រែប្រួល។សម្រាប់គំរូមួយចំនួន វាត្រូវបានគេគិតថា RNA នៅក្នុងប្រតិកម្មសំយោគ cDNA ការពារការផ្សារភ្ជាប់នៃផលិតផល amplification ក្នុងករណីនេះការព្យាបាល RNaseH អាចបង្កើនភាពប្រែប្រួល។ជាទូទៅ ការព្យាបាល RNaseH គឺចាំបាច់នៅពេលពង្រីកគំរូគោលដៅ cDNA ប្រវែងពេញវែង ដូចជា គ្រោងការណ៍មើមចម្លងទាប ទី II ។សម្រាប់គំរូដ៏លំបាកនេះ ការព្យាបាល RNaseH បានពង្រឹងសញ្ញាដែលផលិតដោយ SuperScript II ឬ AMV-synthesized cDNA ។សម្រាប់ប្រតិកម្ម RT-PCR ភាគច្រើន ការព្យាបាល RNaseH គឺស្រេចចិត្ត ពីព្រោះជំហាននៃ PCR denaturation នៅ 95°C ជាទូទៅ hydrolyzes RNA នៅក្នុង RNA:DNA complex។

6. ការកែលម្អវិធីសាស្រ្តរកឃើញ RNA ខ្នាតតូច៖

RT-PCR មានការលំបាកជាពិសេសនៅពេលដែលមាន RNA តិចតួចប៉ុណ្ណោះ។Glycogen ដែលត្រូវបានបន្ថែមជាក្រុមហ៊ុនដឹកជញ្ជូនក្នុងអំឡុងពេលដាច់ដោយឡែក RNA ជួយបង្កើនទិន្នផលនៃគំរូតូចៗ។RNase-free glycogen អាចត្រូវបានបន្ថែមក្នុងពេលតែមួយជាមួយនឹងការបន្ថែម Trizol ។Glycogen គឺរលាយក្នុងទឹក ហើយអាចរក្សាទុកក្នុងដំណាក់កាល aqueous ជាមួយ RNA ដើម្បីជួយដល់ការធ្លាក់ភ្លៀងជាបន្តបន្ទាប់។សម្រាប់សំណាកជាលិកាតិចជាង 50 mg ឬកោសិកាវប្បធម៌ 106 កំហាប់នៃ glycogen ដែលគ្មាន RNase ត្រូវបានណែនាំគឺ 250 μg/ml។

ការបន្ថែម BSA acetylated ទៅនឹងប្រតិកម្មប្រតិចារិកបញ្ច្រាសដោយប្រើ SuperScript II អាចបង្កើនភាពប្រែប្រួល ហើយសម្រាប់ RNA មួយចំនួនតូច កាត់បន្ថយបរិមាណ SuperScript II និងបន្ថែម 40 ឯកតានៃ RNaseOut nuclease inhibitor អាចបង្កើនកម្រិតនៃការរកឃើញ។ប្រសិនបើ glycogen ត្រូវបានប្រើនៅក្នុងដំណើរការដាច់ដោយឡែក RNA វានៅតែត្រូវបានណែនាំឱ្យបន្ថែម BSA ឬ RNase inhibitor នៅពេលប្រើ SuperScript II សម្រាប់ប្រតិកម្មបញ្ច្រាស។

2, បង្កើនភាពជាក់លាក់ RT-PCR

1. ការសំយោគ CND៖

ការសំយោគ cDNA ខ្សែទីមួយអាចត្រូវបានផ្តួចផ្តើមដោយប្រើវិធីសាស្រ្តបីផ្សេងគ្នា ភាពជាក់លាក់ដែលទាក់ទងគ្នាដែលប៉ះពាល់ដល់បរិមាណ និងប្រភេទនៃ cDNA សំយោគ។

វិធីសាស្ត្រ primer ចៃដន្យគឺជាក់លាក់តិចបំផុតនៃវិធីសាស្រ្តទាំងបី។ថ្នាំ primers រំខាននៅកន្លែងជាច្រើននៅទូទាំងប្រតិចារិក បង្កើត cDNAs ខ្លីមួយផ្នែក។វិធីសាស្រ្តនេះត្រូវបានគេប្រើជាញឹកញាប់ដើម្បីទទួលបាន 5′ លំដាប់បញ្ចប់ និងដើម្បីទទួលបាន cDNA ពីគំរូ RNA ជាមួយនឹងតំបន់នៃរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំ ឬជាមួយកន្លែងបញ្ចប់ដែលមិនអាចចម្លងដោយ transcriptase បញ្ច្រាស។ដើម្បីទទួលបាន cDNA ដ៏វែងបំផុត សមាមាត្រនៃ primers ទៅ RNA នៅក្នុងគំរូ RNA នីមួយៗចាំបាច់ត្រូវកំណត់ជាក់ស្តែង។កំហាប់ចាប់ផ្តើមនៃ primers ចៃដន្យមានចាប់ពី 50 ទៅ 250 ng ក្នុងមួយប្រតិកម្ម 20 μl។ចាប់តាំងពី cDNA ត្រូវបានសំយោគពី RNA សរុបដោយប្រើ primers ចៃដន្យគឺជា RNA ribosomal ជាចម្បង poly(A) + RNA ជាទូទៅត្រូវបានជ្រើសរើសជាគំរូ។

ថ្នាំ primers Oligo (dT) គឺជាក់លាក់ជាង primers ចៃដន្យ។វាបង្កាត់ទៅកន្ទុយ poly(A) ដែលបានរកឃើញនៅចុង 3′ នៃ mRNA eukaryotic ភាគច្រើន។ដោយសារតែ poly(A)+ RNA គឺប្រហែល 1% ទៅ 2% នៃ RNA សរុប បរិមាណ និងភាពស្មុគស្មាញនៃ cDNA គឺតិចជាងច្រើនជាមួយ primers ចៃដន្យ។ដោយសារតែភាពជាក់លាក់ខ្ពស់របស់វា oligo(dT) ជាទូទៅមិនតម្រូវឱ្យមានការបង្កើនប្រសិទ្ធភាពនៃសមាមាត្រនៃ RNA ទៅ primers និង poly(A)+ ការជ្រើសរើសទេ។វាត្រូវបានណែនាំឱ្យប្រើ 0.5μg oligo(dT) ក្នុងមួយប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម20μl។oligo(dT)12-18 គឺសមរម្យសម្រាប់ RT-PCR ភាគច្រើន។ប្រព័ន្ធ ThermoScript RT-PCR ផ្តល់ជូន oligo(dT)20 ដោយសារតែស្ថេរភាពកម្ដៅល្អជាងមុនសម្រាប់សីតុណ្ហភាព incubation កាន់តែខ្ពស់។

ហ្សែនជាក់លាក់ primers (GSP) គឺជា primers ជាក់លាក់បំផុតសម្រាប់ជំហានចម្លងបញ្ច្រាស។GSP គឺជាសារធាតុប្រឆាំងអុកស៊ីតកម្ម oligonucleotide ដែលអាចបង្កាត់ជាក់លាក់ទៅនឹងលំដាប់គោលដៅ RNA មិនដូច primers ចៃដន្យ ឬ oligo (dT) ដែលភ្ជាប់ទៅ RNAs ទាំងអស់។ច្បាប់ដូចគ្នាដែលប្រើដើម្បីរចនា PCR primers អនុវត្តចំពោះការរចនានៃ GSP នៅក្នុងប្រតិកម្មប្រតិចារិកបញ្ច្រាស។GSP អាចជាលំដាប់ដូចគ្នានឹង amplification primer ដែលភ្ជាប់ទៅចុង 3′-mRNA ភាគច្រើន ឬ GSP អាចត្រូវបានរចនាឡើងដើម្បី anneal downstream of reverse amplification primer ។សម្រាប់មុខវិជ្ជាដែលពង្រីកមួយចំនួន ត្រូវការ primer antisense ច្រើនជាងមួយ ត្រូវតែត្រូវបានរចនាឡើងសម្រាប់ RT-PCR ដែលទទួលបានជោគជ័យ ព្រោះរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំនៃ RNA គោលដៅអាចការពារការចង primer ។វាត្រូវបានណែនាំឱ្យប្រើ 1 pmol antisense GSP ក្នុងប្រតិកម្មសំយោគ 20 μlដំបូង។

2. បង្កើនសីតុណ្ហភាព incubation សម្រាប់ការចម្លងបញ្ច្រាស៖

ដើម្បីទាញយកអត្ថប្រយោជន៍ពេញលេញពីភាពជាក់លាក់នៃ GSP ប្រតិចារិកបញ្ច្រាសដែលមានកម្តៅខ្ពស់ជាងគួរតែត្រូវបានប្រើ។ប្រតិចារិកបញ្ច្រាសដែលធន់នឹងកំដៅអាចត្រូវបាន incubated នៅសីតុណ្ហភាពខ្ពស់ជាងដើម្បីបង្កើនភាពតឹងរ៉ឹងនៃប្រតិកម្ម។ឧទាហរណ៍ ប្រសិនបើ GSP បញ្ចូលនៅសីតុណ្ហភាព 55°C នោះភាពជាក់លាក់នៃ GSP នឹងមិនត្រូវបានប្រើប្រាស់ពេញលេញទេ ប្រសិនបើ AMV ឬ M-MLV ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការចម្លងបញ្ច្រាសនៅកម្រិតទាបនៃ 37°C។ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយ SuperScript II និង ThermoScript អាចត្រូវបានប្រតិកម្មនៅ 50 ° C ឬខ្ពស់ជាងនេះ ដែលនឹងលុបបំបាត់ផលិតផលដែលមិនជាក់លាក់ដែលបានបង្កើតនៅសីតុណ្ហភាពទាប។សម្រាប់ភាពជាក់លាក់អតិបរមា ល្បាយ RNA/primer អាចត្រូវបានផ្ទេរដោយផ្ទាល់ពីសីតុណ្ហភាព denaturation 65°C ទៅកាន់សីតុណ្ហភាព incubation transcription បញ្ច្រាស ហើយបន្ថែមទៅល្បាយប្រតិកម្ម 2× ដែលក្តៅមុន (ការចាប់ផ្តើមក្តៅការសំយោគ cDNA)។នេះជួយការពារការផ្គូផ្គងមូលដ្ឋានអន្តរម៉ូលេគុលនៅសីតុណ្ហភាពទាប។ការផ្លាស់ប្តូរសីតុណ្ហភាពជាច្រើនដែលត្រូវការសម្រាប់ RT-PCR អាចត្រូវបានធ្វើឱ្យសាមញ្ញដោយប្រើម៉ាស៊ីនកំដៅ។

3. កាត់បន្ថយការចម្លងរោគ DNA ហ្សែន៖

ការលំបាកដែលអាចជួបប្រទះជាមួយ RT-PCR គឺជាការចម្លងរោគនៃ DNA ហ្សែននៅក្នុង RNA ។ការប្រើប្រាស់វិធីសាស្រ្តដាច់ដោយឡែក RNA ដ៏ល្អដូចជា Trizol Reagent នឹងកាត់បន្ថយបរិមាណហ្សែនហ្សែនដែលបំពុលការរៀបចំ RNA ។ដើម្បីជៀសវាងផលិតផលដែលទទួលបានពី DNA ហ្សែន RNA អាចត្រូវបានព្យាបាលដោយ amplification-grade DNase I ដើម្បីលុប DNA ដែលកខ្វក់មុនពេលធ្វើប្រតិចារិកបញ្ច្រាស។ការរំលាយអាហារ DNase I ត្រូវបានបញ្ចប់ដោយការញុះញង់សំណាកក្នុង 2.0 mM EDTA រយៈពេល 10 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 65 អង្សាសេ។EDTA អាច chelate អ៊ីយ៉ុង ម៉ាញេស្យូម ការពារ អ៊ីយ៉ុង ម៉ាញ៉េស្យូម ដែលពឹងផ្អែកលើ RNA hydrolysis នៅសីតុណ្ហភាពខ្ពស់។

ដើម្បីបំបែក cDNA ដែលបានពង្រីកពីការបំពុលផលិតផលពង្រីក DNA ហ្សែន ថ្នាំ primers អាចត្រូវបានរចនាឡើងដែល anneal នីមួយៗដើម្បីបំបែក exons ។ផលិតផល PCR ដែលទទួលបានពី cDNA នឹងមានរយៈពេលខ្លីជាងផលិតផលដែលបានមកពី DNA ហ្សែនកខ្វក់។លើសពីនេះទៀត ការពិសោធន៍ត្រួតពិនិត្យដោយគ្មានការចម្លងបញ្ច្រាសត្រូវបានអនុវត្តនៅលើគំរូ RNA នីមួយៗដើម្បីកំណត់ថាតើបំណែកដែលបានផ្តល់ឱ្យគឺមកពី DNA ឬ cDNA ហ្សែន។ផលិតផល PCR ដែលទទួលបានដោយគ្មានការចម្លងបញ្ច្រាសគឺបានមកពីហ្សែន។