សម្ភារៈចាប់ផ្តើម៖ RNA
ការចម្លងបញ្ច្រាសបរិមាណ PCR (RT-qPCR) គឺជាវិធីសាស្រ្តពិសោធន៍ដែលប្រើក្នុងការពិសោធន៍ PCR ដោយប្រើ RNA ជាសម្ភារៈចាប់ផ្តើម។នៅក្នុងវិធីសាស្រ្តនេះ RNA សរុប ឬ messenger RNA (mRNA) ត្រូវបានចម្លងដំបូងទៅជា DNA បំពេញបន្ថែម (cDNA) ដោយការចម្លងបញ្ច្រាស។ក្រោយមក ប្រតិកម្ម qPCR ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើ cDNA ជាគំរូ។RT-qPCR ត្រូវបានគេប្រើនៅក្នុងកម្មវិធីជីវវិទ្យាម៉ូលេគុលជាច្រើន រួមទាំងការវិភាគហ្សែន ការត្រួតពិនិត្យការជ្រៀតជ្រែក RNA សុពលភាពមីក្រូអារេ ការរកឃើញធាតុបង្កជំងឺ ការធ្វើតេស្តហ្សែន និងការស្រាវជ្រាវជំងឺ។
វិធីសាស្រ្តមួយជំហាន និងពីរជំហានសម្រាប់ RT-qPCR
RT-qPCR អាចត្រូវបានសម្រេចដោយវិធីសាស្រ្តមួយជំហាន ឬពីរជំហាន។RT-qPCR មួយជំហានរួមបញ្ចូលគ្នានូវការចម្លងបញ្ច្រាស និងការពង្រីក PCR ដែលអនុញ្ញាតឱ្យ transcriptase បញ្ច្រាស និង DNA polymerase បំពេញប្រតិកម្មនៅក្នុងបំពង់តែមួយក្រោមលក្ខខណ្ឌផ្ទុកដូចគ្នា។RT-qPCR មួយជំហានតម្រូវឱ្យប្រើ primers ជាក់លាក់តាមលំដាប់ប៉ុណ្ណោះ។នៅក្នុង RT-qPCR ពីរជំហាន ការចម្លងបញ្ច្រាស និងការពង្រីក PCR ត្រូវបានអនុវត្តនៅក្នុងបំពង់ពីរ ដោយប្រើប៊ូហ្វ័រដែលបានកែលម្អខុសៗគ្នា លក្ខខណ្ឌប្រតិកម្ម និងយុទ្ធសាស្ត្ររចនាបឋម។
| អត្ថប្រយោជន៍ | គុណវិបត្តិ | |
| មួយជំហាន | វិធីសាស្រ្តនេះមានកំហុសក្នុងការពិសោធន៍តិចជាងមុន ដោយសារប្រតិកម្មទាំងពីរត្រូវបានធ្វើក្នុងមួយបំពង់
ជំហានបំពង់តិចកាត់បន្ថយហានិភ័យនៃការចម្លងរោគ
ស័ក្តិសមសម្រាប់ការពង្រីក/ការបញ្ចាំងស្គ្រីនដែលមានល្បឿនលឿន និងអាចផលិតឡើងវិញបាន។ | ប្រតិកម្មពីរជំហានមិនអាចត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរដោយឡែកពីគ្នាទេ។
ដោយសារលក្ខខណ្ឌប្រតិកម្មត្រូវបានសម្របសម្រួលដោយការបញ្ចូលគ្នានៃប្រតិកម្មពីរជំហាន ភាពប្រែប្រួលគឺមិនល្អដូចវិធីសាស្ត្រពីរជំហាននោះទេ។
ចំនួនគោលដៅដែលបានរកឃើញដោយគំរូតែមួយគឺតូច |
| ពីរជំហាន | សមត្ថភាពក្នុងការបង្កើតបណ្ណាល័យ cDNA ដែលមានស្ថេរភាពដែលអាចត្រូវបានរក្សាទុកក្នុងរយៈពេលយូរ និងប្រើក្នុងប្រតិកម្មច្រើន
ហ្សែនគោលដៅ និងហ្សែនយោងអាចត្រូវបានពង្រីកពីបណ្ណាល័យ cDNA ដូចគ្នាដោយមិនចាំបាច់មានបណ្ណាល័យ cDNA ច្រើន
សតិបណ្ដោះអាសន្នប្រតិកម្ម និងលក្ខខណ្ឌប្រតិកម្មដែលអនុញ្ញាតឱ្យបង្កើនប្រសិទ្ធភាពនៃការដំណើរការប្រតិកម្មតែមួយ
ជម្រើសដែលអាចបត់បែនបាននៃលក្ខខណ្ឌកេះ | ការប្រើបំពង់ច្រើន និងជំហានបំពង់កាន់តែច្រើនបង្កើនហានិភ័យនៃការចម្លងរោគ DNA និងចំណាយពេលច្រើន។
ទាមទារការបង្កើនប្រសិទ្ធភាពច្រើនជាងវិធីសាស្ត្រមួយជំហាន |
ផលិតផលដែលពាក់ព័ន្ធ៖
RT-qPCR Easyᵀᴹ (ជំហានមួយ)-SYBR Green I
RT-qPCR ងាយស្រួលᵀᴹ (ជំហានមួយ)-Taqman
RT Easyᵀᴹ I Master Premix សម្រាប់ First-strand CDNA Synthesis
ពេលវេលាពិត PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
ការជ្រើសរើស RNA និង mRNA សរុប
នៅពេលរចនាការពិសោធន៍ RT-qPCR វាជារឿងសំខាន់ក្នុងការសម្រេចចិត្តថាតើត្រូវប្រើ RNA សរុប ឬ mRNA បន្សុតជាគំរូសម្រាប់ការចម្លងបញ្ច្រាស។ទោះបីជា mRNA អាចផ្តល់នូវភាពប្រែប្រួលខ្ពស់បន្តិចក៏ដោយ RNA សរុបនៅតែត្រូវបានប្រើប្រាស់ញឹកញាប់។ហេតុផលសម្រាប់នេះគឺថា RNA សរុបមានអត្ថប្រយោជន៍សំខាន់ជាងជាសម្ភារៈចាប់ផ្តើមជាង mRNA ។ទីមួយ ដំណើរការនេះតម្រូវឱ្យមានជំហានបន្សុតតិចជាងមុន ដែលធានាបាននូវការស្ដារឡើងវិញនូវគំរូបរិមាណកាន់តែប្រសើរ និងការធ្វើឱ្យមានលទ្ធផលធម្មតាប្រសើរជាងមុនដល់ការចាប់ផ្តើមលេខក្រឡា។ទីពីរ វាជៀសវាងជំហាននៃការពង្រឹង mRNA ដែលអាចជៀសវាងពីលទ្ធភាពនៃលទ្ធផលដែលមិនច្បាស់លាស់ដោយសារតែការងើបឡើងវិញនៃ mRNAs ផ្សេងៗគ្នា។សរុបមក ដោយសារនៅក្នុងកម្មវិធីភាគច្រើន បរិមាណទាក់ទងនៃហ្សែនគោលដៅគឺសំខាន់ជាងភាពប្រែប្រួលដាច់ខាតនៃការរកឃើញនោះ RNA សរុបគឺសមរម្យជាងនៅក្នុងករណីភាគច្រើន។
primer ចម្លងបញ្ច្រាស
នៅក្នុងវិធីសាស្រ្តពីរជំហាន វិធីសាស្រ្តបីផ្សេងគ្នាអាចត្រូវបានប្រើដើម្បីចាប់ផ្តើមប្រតិកម្ម cDNA: primers oligo (dT) primers ចៃដន្យ ឬ primers ជាក់លាក់តាមលំដាប់។ជាធម្មតា ថ្នាំ primers oligo (dT) និង primers ចៃដន្យ ត្រូវបានប្រើក្នុងការរួមបញ្ចូលគ្នា។ថ្នាំ primers ទាំងនេះភ្ជាប់ទៅទម្រង់ mRNA strand និងផ្តល់នូវ transcriptase បញ្ច្រាសជាមួយនឹងចំណុចចាប់ផ្តើមសម្រាប់ការសំយោគ។
| ការជ្រើសរើសបឋម | រចនាសម្ព័ន្ធនិងមុខងារ | អត្ថប្រយោជន៍ | គុណវិបត្តិ |
| ថ្នាំ primer Oligo (dT) (ឬ oligo (dT) primer) | ពង្រីកការស្រមុកទៅនឹងសំណល់ thymine នៅកន្ទុយ poly(A) នៃ mRNA;យុថ្កា oligo (dT) primer មាន G, C, ឬ A នៅខាងចុង 3′ (ទីតាំងយុថ្កា) | ការសំយោគ cDNA ប្រវែងពេញលេញពី mRNA កន្ទុយ poly(A)
អាចអនុវត្តបាននៅពេលដែលមានសម្ភារៈចាប់ផ្តើមតិច
កន្លែងដាក់យុថ្កាធានាថា oligo(dT) primer ភ្ជាប់ទៅនឹងកន្ទុយ 5′ poly(A) នៃ mRNA | សមរម្យសម្រាប់តែការពង្រីកហ្សែនដែលមានកន្ទុយ poly(A) ប៉ុណ្ណោះ។
ទទួលបាន cDNA កាត់ចេញពីកន្លែងដាក់បឋម*2 ជា poly(A)
លំអៀងទៅចង 3′ ចុង*
* លទ្ធភាពនេះត្រូវបានបង្រួមអប្បបរមាប្រសិនបើថ្នាំ primers oligo (dT) ត្រូវបានប្រើប្រាស់ |
| primer ចៃដន្យ
| ប្រវែងមូលដ្ឋានពី 6 ទៅ 9 ដែលអាចភ្ជាប់ទៅកាន់គេហទំព័រជាច្រើនក្នុងអំឡុងពេលប្រតិចារិក RNA | បញ្ចូលទៅក្នុង RNA ទាំងអស់ (tRNA, rRNA, និង mRNA)
ស័ក្តិសមសម្រាប់ប្រតិចារិកដែលមានរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំសំខាន់ៗ ឬនៅពេលដែលមានសម្ភារៈចាប់ផ្តើមតិចជាងមុន។
ទិន្នផល cDNA ខ្ពស់។ | cDNA ត្រូវបានចម្លងបញ្ច្រាសពី RNA ទាំងអស់ ដែលជាធម្មតាមិនត្រូវបានគេចង់បាន និងអាចបន្ថយសញ្ញានៃ mRNA គោលដៅ
កាត់បន្ថយ cDNA |
| primers ជាក់លាក់តាមលំដាប់ | primers ផ្ទាល់ខ្លួនកំណត់គោលដៅជាក់លាក់ mRNA លំដាប់ | បណ្ណាល័យ cDNA ជាក់លាក់
ធ្វើអោយប្រសើរឡើងនូវភាពរសើប
ការប្រើប្រាស់ថ្នាំ primers qPCR បញ្ច្រាស | កំណត់ត្រឹមតែការសំយោគហ្សែនគោលដៅតែមួយប៉ុណ្ណោះ។ |
ប្រតិចារិកបញ្ច្រាស
Reverse transcriptase គឺជាអង់ស៊ីមដែលប្រើ RNA ដើម្បីសំយោគ DNA ។ប្រតិចារិកបញ្ច្រាសមួយចំនួនមានសកម្មភាព RNase ហើយអាចបន្ទាបបន្ថោកខ្សែ RNA នៅក្នុងខ្សែ RNA-DNA កូនកាត់បន្ទាប់ពីការចម្លង។ប្រសិនបើវាមិនមានសកម្មភាពអង់ស៊ីម RNase នោះ RNaseH អាចត្រូវបានបន្ថែមសម្រាប់ប្រសិទ្ធភាព qPCR ខ្ពស់។អង់ស៊ីមដែលប្រើជាទូទៅរួមមាន Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase និង avian myeloblastoma virus reverse transcriptase ។សម្រាប់ RT-qPCR វាជាការល្អក្នុងការជ្រើសរើស transcriptase បញ្ច្រាសដែលមានភាពធន់ខ្ពស់ ដូច្នេះការសំយោគ cDNA អាចត្រូវបានអនុវត្តនៅសីតុណ្ហភាពខ្ពស់ ធានាបាននូវការចម្លង RNAs ប្រកបដោយជោគជ័យជាមួយនឹងរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំខ្ពស់ ខណៈពេលដែលរក្សាបាននូវសកម្មភាពពេញលេញរបស់ពួកគេពេញមួយប្រតិកម្ម ដែលនាំឱ្យទិន្នផល cDNA កាន់តែខ្ពស់។
ផលិតផលដែលពាក់ព័ន្ធ៖
Foreasy M-MLV Reverse Transcriptase
សកម្មភាព RNase H នៃការចម្លងបញ្ច្រាស
RNaseH អាចបំប្លែងខ្សែ RNA ចេញពី RNA-DNA duplexes ដែលអនុញ្ញាតឱ្យសំយោគ DNA ពីរខ្សែប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាព។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ នៅពេលប្រើ mRNA វែងជាគំរូ RNA អាចត្រូវបានបង្ខូចមុនអាយុ ដែលបណ្តាលឱ្យ cDNA កាត់ខ្លី។ដូច្នេះ ជាញឹកញាប់វាមានប្រយោជន៍ក្នុងការកាត់បន្ថយសកម្មភាព RNaseH កំឡុងពេលការក្លូន cDNA ប្រសិនបើការសំយោគនៃប្រតិចារិកវែងគឺចង់បាន។ផ្ទុយទៅវិញ ប្រតិចារិកបញ្ច្រាសជាមួយនឹងសកម្មភាព RNase H ច្រើនតែមានប្រយោជន៍សម្រាប់កម្មវិធី qPCR ព្រោះវាបង្កើនការរលាយនៃ RNA-DNA duplexes ក្នុងអំឡុងពេលវដ្តដំបូងនៃ PCR ។
ការរចនាបឋម
ថ្នាំ primers PCR ដែលប្រើសម្រាប់ជំហាន qPCR ក្នុង RT-qPCR គួរតែត្រូវបានរចនាឡើងតាមឧត្ដមគតិដើម្បីពង្រីកប្រសព្វ exon-exon ដែល primer amplification អាចពង្រីកព្រំដែន exon-intron ជាក់ស្តែង។ចាប់តាំងពីលំដាប់ DNA ហ្សែនដែលមានផ្ទុកខាងក្នុងមិនត្រូវបានពង្រីក ការរចនានេះកាត់បន្ថយហានិភ័យនៃផលវិជ្ជមានក្លែងក្លាយដែលត្រូវបានពង្រីកពីការបំពុល DNA ហ្សែន។
ប្រសិនបើ primers មិនអាចត្រូវបានរចនាឡើងដើម្បីបំបែកព្រំដែន exons ឬ exon-exon បានទេ វាអាចចាំបាច់ក្នុងការព្យាបាលគំរូ RNA ជាមួយនឹង RNase-free DNase I ឬ dsDNase ដើម្បីលុបការចម្លងរោគ DNA ហ្សែន។
ការត្រួតពិនិត្យ RT-qPCR
ការត្រួតពិនិត្យអវិជ្ជមាននៃការចម្លងបញ្ច្រាស (-RT control) គួរតែត្រូវបានរួមបញ្ចូលនៅក្នុងការពិសោធន៍ RT-qPCR ទាំងអស់ ដើម្បីរកមើលការចម្លងរោគ DNA (ដូចជាផលិតផល DNA ហ្សែន ឬ PCR ពីប្រតិកម្មពីមុន)។ការគ្រប់គ្រងនេះមានសមាសធាតុប្រតិកម្មទាំងអស់ លើកលែងតែ បញ្ច្រាស transcriptase ។ដោយសារការចម្លងបញ្ច្រាសមិនកើតឡើងជាមួយនឹងការគ្រប់គ្រងនេះ ប្រសិនបើការពង្រីក PCR ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញ ការចម្លងរោគពី DNA គឺទំនងជាភាគច្រើន។
ពេលវេលាផ្សាយ៖ សីហា-០២-២០២២
